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| 问题一：转膜不充分 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 膜没有*均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10kDa | 选择小孔径的膜，缩短转移时间 |
| 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值 | 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH10.5）或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 |
| 甲醇浓度过高 | 过高甲醇浓度浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 |
| 转移时间不够 | 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 |
| 问题二：背景高 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 膜没有*均匀湿透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液体积和洗涤次数 |
| 封闭不充分 | 增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等） |
| 二抗浓度过高 | 降低二抗浓度 |
| 检测过程中膜干燥 | 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 |
| 曝光过度 | 缩短曝光时间 |
| 抗体与封闭蛋白有交叉反应 | 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 |
| 二抗的非特异性背景 | 增加一个二抗对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重连的） |
| 问题三：无信号 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶失活 | 直接将酶和底物进行混合你，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内。有活性的酶联物 |
| 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 设置阳性对照，如果阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加样本上样量解决靶蛋白含量低的原因 |
| 试剂之间不匹配 | 一抗与标本种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 |
| 一抗失效 | 选择有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有* |
| 问题四：弱信号 | |
| 可能的原因 | 验证或解决办法 |
| 抗体染色不充分 | 增加抗体浓度，延长孵育时间 |
| 酶活性降低 | 直接将酶和底物进行混合，如果显色弱则说明酶活性降低了。选择在有效期内、有活性的酶联物 |
| 标本中靶蛋白含量太低 | 增加标本上样量 |
| 洗膜过度 | 缩短洗涤时间和次数 |
| 抗体活性降低 | 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 |
| 蛋白转移不充分 | 见上述 |
| 封闭过度 | 较少封闭剂的量或缩短时间；更换不同封闭剂类型 |
| 曝光时间过短 | 延长曝光时间 |
| HRP抑制剂 | 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠 |
| 问题五：非特异性条带（多条带） | |
| 可能的原因 | 验证或解决办法 |
| 二抗的非特异性结合 | 增加一个二抗对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） |
| 一抗的特异性不够 | 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 |
| 蛋白降解 | 使用新鲜制备的抗体，并使用蛋白酶抑制剂 |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 |
| 不同剪切体存在 | 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的 |
| 细胞传代过多导致蛋白变异 | 使用原代或传代少的细胞作对照 |
| 蛋白上样量过大 | 降低上样量 |
| 问题六：条带大小不对 | |
| 可能的原因 | 验证或解决办法 |
| 二聚体或多聚体存在 | 增加蛋白质变性过程及强度 |
| 翻译后剪切 | 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能是需要进行剪切成活化的形式，如procaspases |
| 相对电荷 | 氨基酸的组成（charged vs non-charged） |
| 蛋白修饰 | 比如氨基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加 |
| 问题七：背景有黑色斑点 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 封闭试剂中有聚集体 | 使用前过滤封闭试剂 |
| 抗体和封闭试剂反应 | 使用前过滤封闭试剂 |
| HRP偶联二抗中有聚集体 | 过滤二抗试剂，去除聚集体 |
| 问题八：背景有不均匀的白色斑点 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 转膜过程中有气泡产生 | 仔细检查，避免存在气泡 |
| 抗体分布不均匀 | 孵育抗体时使用摇床 |
| 问题九：膜出现反像（白色带） | |
| 可能的原因 | 验证或解决方式 |
| HRP含量过高 | 降低酶联二抗的浓度 |
| 问题十：微小条带 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 电泳速度过快 | 减少电压等减慢电泳速度 |
| 电泳温度过高 | 在冷室或者冰浴中进行电泳，改变电泳PH值 |
| 问题十一：Marker变黑色 | |
| 可能的原因 | 验证或解决方法 |
| 抗体和Marker蛋白反应 | 在Maeker和sample之间空出一个孔不上样 |
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