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WB Trouble Shooting

更新时间:2018-03-20      点击次数:1897
 
问题一:转膜不充分
可能的原因 验证或解决方法
膜没有*均匀湿透 使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10kDa 选择小孔径的膜,缩短转移时间
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液(pH10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液
甲醇浓度过高 过高甲醇浓度浓度会导致蛋白质与SDS分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

 

问题二:背景高
可能的原因 验证或解决方法
膜没有*均匀湿透 使用100%甲醇浸透膜
洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数
封闭不充分 增加封闭液孵育时间,或者提高温度。选择合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白等)
二抗浓度过高 降低二抗浓度
检测过程中膜干燥 保证充分的反应液,避免出现干膜现象
曝光过度 缩短曝光时间
抗体与封闭蛋白有交叉反应 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应
二抗的非特异性背景 增加一个二抗对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重连的)

 

问题三:无信号
可能的原因 验证或解决方法
抗体染色不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间
酶失活 直接将酶和底物进行混合你,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内。有活性的酶联物
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照,如果阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加样本上样量解决靶蛋白含量低的原因
试剂之间不匹配 一抗与标本种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效 选择有效期内抗体;并选择现配现用的工作液
HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有*

 

问题四:弱信号
可能的原因 验证或解决办法
抗体染色不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间
酶活性降低 直接将酶和底物进行混合,如果显色弱则说明酶活性降低了。选择在有效期内、有活性的酶联物
标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量
洗膜过度 缩短洗涤时间和次数
抗体活性降低 选择在有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置
蛋白转移不充分 见上述
封闭过度 较少封闭剂的量或缩短时间;更换不同封闭剂类型
曝光时间过短 延长曝光时间
HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠

 

问题五:非特异性条带(多条带)
可能的原因 验证或解决办法
二抗的非特异性结合 增加一个二抗对照:不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗(特异性更强的,只针对重链的)
一抗的特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体的特异性
蛋白降解 使用新鲜制备的抗体,并使用蛋白酶抑制剂
抗体浓度过高 降低抗体(一抗、二抗)浓度,可以减少非特异性条带
不同剪切体存在 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法,每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
细胞传代过多导致蛋白变异 使用原代或传代少的细胞作对照
蛋白上样量过大 降低上样量

 

问题六:条带大小不对
可能的原因 验证或解决办法
二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度
翻译后剪切 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能是需要进行剪切成活化的形式,如procaspases
相对电荷 氨基酸的组成(charged vs non-charged)
蛋白修饰 比如氨基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加

 

问题七:背景有黑色斑点
可能的原因 验证或解决方法
封闭试剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂
抗体和封闭试剂反应 使用前过滤封闭试剂
HRP偶联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂,去除聚集体

 

问题八:背景有不均匀的白色斑点
可能的原因 验证或解决方法
转膜过程中有气泡产生 仔细检查,避免存在气泡
抗体分布不均匀 孵育抗体时使用摇床

 

问题九:膜出现反像(白色带)
可能的原因 验证或解决方式
HRP含量过高 降低酶联二抗的浓度

 

问题十:微小条带
可能的原因 验证或解决方法
电泳速度过快 减少电压等减慢电泳速度
电泳温度过高 在冷室或者冰浴中进行电泳,改变电泳PH值

 

问题十一:Marker变黑色
可能的原因 验证或解决方法
抗体和Marker蛋白反应 在Maeker和sample之间空出一个孔不上样

 

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