IHC Trouble Shooting

更新时间：2018-03-26 点击次数：1735

问题一：缺乏染色
可能的原因	检测方法和相应的措施
没有抗原	用原位杂交的方法检测蛋白表达（有时即使能检测到mRNA。翻译也有可能受阻）
由于错误的储存方法	按照说明书储存。通常，将抗体按照足够配制单次实验工作溶液的体积分装。储存在手动除霜冰箱中（-20到-70℃），避免反复冻融
无效的一抗或二抗	单独检查报告系统以评估试剂的有效性。
固定不充分	尝试增加固定时间或改用不同的固定剂
过度固定	减少浸润或固定后步骤的时间。如果必须使用浸润法固定（例如病理实验室中的尸检组织或切片），可以用抗原修复试剂修复被遮蔽的表位
不兼容的二抗和一抗	使用可以与一抗结合的二抗。例如，如果一抗是兔源的，则使用抗兔的二抗
在与一抗孵育前抗原被破坏	如果内源性过氧化物酶的封闭是在加入一抗前进行的，则改为加入一抗之后在封闭
在固定或包埋过程中表位发生改变	尝试使用不同的抗原修复技术修复免疫反应性。在58℃以下包埋组织。
抗原修复无效	增加修复时间或更换修复液
漏用试剂或未按正确的顺序加入试剂	重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序正确

问题二：高背景
可能的原因	检测方法和相应的措施
一抗或二抗的浓度过高	对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的*浓度
抗体和组织中蛋白的疏水相互作用	降低抗体稀释液的离子强度（降低盐浓度对单克隆抗体尤其有效）
一抗和/或二级试剂与组织的非特异性结合	一抗孵育前进行封闭（我们用1%的牛血清蛋白或者10%的正常驴血清，也可以使用脱脂奶粉）
二抗的非特异性结合	使用去除了交叉反应性IgG的抗体（针对样品目标种属去除）
组织过于干燥	在染色过程中避免组织干燥
试剂粘附在旧的或未制备好的玻片上	用新鲜制备或购买的玻片进行实验
由于离子相互作用造成的背景	增加稀释缓冲液的离子强度

问题三：细胞/组织的形态被破坏
可能的原因	检测方法和相应措施
抗原修复方法过于激烈	在抗原修复的时候根据经验确定合适的条件以保持组织形态
组织切片从玻片上脱落（更常见于冰冻切片）	增加固定时间。根据经验增加额外的或更换固定剂。使用新鲜准备的，带有充足电荷的玻片
组织切片撕裂或皱褶。切片下有气泡	使用锋利的刀片重新切片或者在分析结果的时候忽略受损的区域
组织形态难以分辨	切片的时候切得薄些。冰晶有可能破坏冰冻切片的形态
固定不充分的组织或细胞在染色时可能遭到破坏	增加固定时间和/或进行二次固定。提高固定剂/组织的比例。将组织切的较小以获得更*的浸润固定
组织的自发裂解产生很多染色的坏死碎片	增加固定时间，比率。考虑使用交联性固定剂