组化笔的实验原理与意义

    自制组化笔在免疫组化染色中的应用戴晓淳，组化笔在免疫组化染色中，为防止抗体外溢和被稀释，必须擦掉切片组织周边的液体，耗时费力。采用Ｓ—Ｐ法免疫组化染色的切片经二甲苯脱蜡、纯酒精脱苯后，用自制组化笔在切片组织周围画一圆圈，再逐级水化，以后染色步骤按试剂盒说明进行。目前，国外生产的组化笔，价格贵，国内尚未生产。用自制的组化笔经标记后，每步只需甩掉液体后直接滴加抗体进行染色，此时滴加的抗体被限定在组化笔所划好的范围内，无外流现象。本法每张切片平均滴加抗体２０～３０ｍｌ，明显节省了抗体，染色结果与擦片法比较也无明显差别，此油性圈在组化染色完成后，经酒精逐级脱水、二甲苯透明后即可去除。将液体灌入废弃的ＭＡＲＫＥＲ笔或水彩笔，即成组化笔。

    细胞通透、封闭内源性过氧化物酶，用封闭通透液浸润切片30min（RT 避光）配法是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加 400 ul 30％H 2 O 2 。PBS 溶液洗 3 次×3 min。抗原修复暴露抗原决定族 10) 切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4min至沸腾后，再加热约 6 min×4 次， 每次间隔补足液体， 防止干片。封闭非特异性蛋白 11) PBS 溶液洗 3 次×3 min； 12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈, 在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中，室温30（10～30）min。一抗孵育 13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入 已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需 37 ℃复温 45 min。二抗孵育。将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次。用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30min（回收）。