免疫共沉淀Co-IP的实验优化

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质间相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如下图所示，如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

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免疫共沉淀的操作方法本身较为简单，我们abs955 IP/CoIP试剂盒说明书对操作流程有完整说明，但为了获得更好的实验结果，相关的实验步骤需要根据实际情况进行优化。

1）裂解和洗涤缓冲液

裂解和洗涤缓冲液是维持复合物形成的关键因素。我们试剂盒配备的Lysis buffer使用优化的非变性裂解缓冲液，许多蛋白间的相互作用将保持完整。一般认为含有非离子型洗涤剂的低离子强度缓冲液（即<120mM NaCl）不太可能破坏蛋白间的相互作用。另外应避免在洗涤期间用超声或涡旋处理的方法裂解细胞、裂解物或珠子结合的免疫复合物，以防止破坏复合物间的相互作用。离心过程中应轻柔处理样品以确保减少复合物的损失。

2）固相支持物beads的选择

用于免疫共沉淀的固相支持物一般有琼脂糖珠和磁珠两种。琼脂糖珠由于其多孔表面、通常具有更高的结合能力，而磁珠在有条件的实验室操作相对更简便。我们的试剂盒配备优质Protein A/G 琼脂糖珠，有效性经开发试验充分验证。

3）非特异性作用的高背景

由于细胞裂解物中存在大量蛋白质，因此在操作过程中可能会发生与目标复合物的非特异性结合。这些非特异性相互作用一般通过*清洗珠子结合的免疫复合物来打破，但也可以应用其他策略来优化非特异性结合，例如：

(1)、通过将盐浓度从120mM滴定至1000mM来改变缓冲液的离子强度
(2)、减少一抗的使用量，直到信号干扰比大化
(3)、参考我们推荐的操作步骤，进行细胞裂解物预清除（可选步骤）

4）抗体污染（IgG交叉反应）的优化

免疫共沉淀Co-IP中常遇到的问题是在WB分析中来自抗体IgG条带的干扰，IgG的轻重链在25kD和50kD左右，并且在SDS-PAGE中可能会有<5kD的偏移。针对这种情况可以采用以下几种方法进行优化：

(1)、IP和WB采用不同来源抗体，IP为鼠源则WB可以选用兔抗。
(2)、采用特异性识别IgG轻链或者重链的二抗，如目的蛋白与IgG轻链接近、则可采用重链二抗。
(3)、运用交联剂将IP抗体和Protein A/G -Beads交联，通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体- (4)、Protein A/G-beads复合物，后离心去除复合物，上清中只留下目的蛋白。
(5)、将常用的融合标签掺入用于Co-IP主要靶蛋白中时，预固定的抗融合标签抗体可用于蛋白质复合物纯化。
WB分析前，可以考虑采用低pH洗脱来代替煮沸，低pH值（2-3）可以降低抗原/抗体相互作用、从而将抗原和抗体分离（如1M甘氨酸缓冲液，pH 2-3），注意电泳前需平衡pH。

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