大鼠骨髓间充质干细胞体外 CFSE 染色标记的实验研究

骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种位于骨髓微环境、具有多 向分化潜能的成体干细胞。因其取材方便简单、能 在体外大量扩增、可自体移植避免免疫排斥和伦理 问题，已成为理想的组织工程种子细胞和基因治疗 的靶细胞。文献报道，MSCs 移植可用于治疗正 己烷中毒导致的周围神经。BMSCs 如应用于 组织工程和基因治疗，首先需要解决的问题之一是 如何高效、安全地标记 BMSCs，进而跟踪其在体内 的归巢、分化、存活等系列过程。

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5，6 － carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是 一种可穿过细胞膜、与细胞内氨基不可逆结合的荧 光染料，因其标记效率高、容易检测、无放射性而逐 渐得到广泛应用。本研究将 CFSE 用于 BMSCs 的体外标记，并探讨其最佳标记浓度和最佳标记时 间，旨在探索建立体外 BMSCs 的 CFSE 标记方法，为 BMSCs 的移植研究提供实验基础。

BMSCs 的 CFSE 标记

荧光显微镜下观察可见，标记 CFSE 的 BMSCs 细胞膜、细胞质和细胞核都发出绿色荧光，整个细胞 呈绿色，细胞核的荧光强度最高。CFSE 标记的 BMSCs 仍保持良好的细胞形态，呈梭形或多角形。BMSCs 标记 CFSE 后进行 Hochest 33342 染 色，以计算 CFSE 标记率，结果显示:CFSE 浓度为 2． 5 μmol /L、标记时间为 20 min 及以上时，标记率 基本为 100 % ;5 μmol /L 或 10 μmol /L 的 CFSE 标 记 15 min，细胞标记率即基本为 100 % ;CFSE 浓度 为 20 μmol /L 时，仅标记 5 min 就能使细胞几乎 100% 标记;CFSE 浓度 ＞ 10 μmol /L，作用时间 ＞ 15 min 时，CFSE 的浓度和作用时间对标记率无明显影 响(P ＞ 0． 05)。

CFSE 标记对 BMSCs 存活率的影响 
10 μmol /L CFSE 标记 BMSCs 的时间≤15 min 时，BMSCs 的存活率基本不受影响，但当标记时间 为 20 min 或 30 min 时，BMSCs 的存活率显著下降 (P ＜ 0． 05)，仅分别为 92． 67 % 和 70． 33% 。 不同浓度 CFSE 标记对 BMSCs 存活率的影响结果显 示，2． 5、5、10 μmol /L CFSE 标记 BMSCs 15 min 均不 影响细胞活性(P ＞ 0． 05)，20 μmol /L CFSE 标记 15 min 使 BMSCs 的存活率显著下降为 87． 45 % 。

CFSE 是一种可标记活细胞的荧光染料，具有较 强的细胞膜通透性。CFSE 进入细胞后，其乙酸基团 可被细胞内酯酶水解去除，丧失膜通透性，而具有很 高的荧光活性，被激发将发生绿色荧光。此时的 CFSE 能与细胞骨架蛋白形成可激发荧光的蛋白复 合物，该复合物不能脱离细胞，且不会污染邻近细 胞，使非标记细胞免受染料影响

本实验证明， CFSE 标记 BMSCs 的细胞膜、细胞核及细胞质都带 有绿色荧光，且标记细胞的形态不受影响。台盼蓝 结果显示，CFSE 浓度 ＜ 20 μmol /L、标记时间 ＜ 20 min 时，BMSCs 的 存 活 率 均 未 受 影 响。Dumitriu 等报道，CFSE 标记细胞后不会引起细胞的凋亡 或坏死，而且细胞凋亡坏死后，标记的 CFSE 仍能稳 定地留存于细胞中且不影响凋亡和坏死的发生，以 上结果同时证明 CFSE 标记不影响细胞的生命活 动。但当 CFSE 标记浓度达到 20 μmol /L 或标记时 间 ＞ 20 min 时，BMSCs 的存活率将会降低，甚至部 分细胞出现死亡。故在 CFSE 对 BMSCs 标记率都达 到 100% 的前提下，本研究选择 CFSE 较低的作用浓 度和较短的作用时间，即 10 μmol /L CFSE 标记 15 min，作为 CFSE 标记 BMSCs 的最佳条件，以在达到 CFSE 最佳标记效果的同时保持最佳的细胞活性。

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本文参考文献: 
大鼠骨髓间充质干细胞体外 CFSE 染色标记的实验研究 
陈若霖1 ，朴丰源1 ，李双月1 ，王哲敏1 ，戚 媛1 ，刘 爽1 ，关 怀2 ，金河天3 (1． 大连医科大学 劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁 大连 116044; 2．