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大鼠骨髓间充质干细胞体外 CFSE 染色标记的实验研究

更新时间:2021-06-07      点击次数:1067

骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种位于骨髓微环境、具有多 向分化潜能的成体干细胞。因其取材方便简单、能 在体外大量扩增、可自体移植避免免疫排斥和伦理 问题,已成为理想的组织工程种子细胞和基因治疗 的靶细胞。文献报道,MSCs 移植可用于治疗正 己烷中毒导致的周围神经。BMSCs 如应用于 组织工程和基因治疗,首先需要解决的问题之一是 如何高效、安全地标记 BMSCs,进而跟踪其在体内 的归巢、分化、存活等系列过程。

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6 - carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)是 一种可穿过细胞膜、与细胞内氨基不可逆结合的荧 光染料,因其标记效率高、容易检测、无放射性而逐 渐得到广泛应用。本研究将 CFSE 用于 BMSCs 的体外标记,并探讨其最佳标记浓度和最佳标记时 间,旨在探索建立体外 BMSCs 的 CFSE 标记方法,为 BMSCs 的移植研究提供实验基础。


BMSCs 的 CFSE 标记

荧光显微镜下观察可见,标记 CFSE 的 BMSCs 细胞膜、细胞质和细胞核都发出绿色荧光,整个细胞 呈绿色,细胞核的荧光强度最高。CFSE 标记的 BMSCs 仍保持良好的细胞形态,呈梭形或多角形。BMSCs 标记 CFSE 后进行 Hochest 33342 染 色,以计算 CFSE 标记率,结果显示:CFSE 浓度为 2. 5 μmol /L、标记时间为 20 min 及以上时,标记率 基本为 100 % ;5 μmol /L 或 10 μmol /L 的 CFSE 标 记 15 min,细胞标记率即基本为 100 % ;CFSE 浓度 为 20 μmol /L 时,仅标记 5 min 就能使细胞几乎 100% 标记;CFSE 浓度 > 10 μmol /L,作用时间 > 15 min 时,CFSE 的浓度和作用时间对标记率无明显影 响(P > 0. 05)。





CFSE 标记对 BMSCs 存活率的影响
 
10 μmol /L CFSE 标记 BMSCs 的时间≤15 min 时,BMSCs 的存活率基本不受影响,但当标记时间 为 20 min 或 30 min 时,BMSCs 的存活率显著下降 (P < 0. 05),仅分别为 92. 67 % 和 70. 33% 。 不同浓度 CFSE 标记对 BMSCs 存活率的影响结果显 示,2. 5、5、10 μmol /L CFSE 标记 BMSCs 15 min 均不 影响细胞活性(P > 0. 05),20 μmol /L CFSE 标记 15 min 使 BMSCs 的存活率显著下降为 87. 45 % 。

CFSE 是一种可标记活细胞的荧光染料,具有较 强的细胞膜通透性。CFSE 进入细胞后,其乙酸基团 可被细胞内酯酶水解去除,丧失膜通透性,而具有很 高的荧光活性,被激发将发生绿色荧光。此时的 CFSE 能与细胞骨架蛋白形成可激发荧光的蛋白复 合物,该复合物不能脱离细胞,且不会污染邻近细 胞,使非标记细胞免受染料影响


本实验证明, CFSE 标记 BMSCs 的细胞膜、细胞核及细胞质都带 有绿色荧光,且标记细胞的形态不受影响。台盼蓝 结果显示,CFSE 浓度 < 20 μmol /L、标记时间 < 20 min 时,BMSCs 的 存 活 率 均 未 受 影 响。Dumitriu 等报道,CFSE 标记细胞后不会引起细胞的凋亡 或坏死,而且细胞凋亡坏死后,标记的 CFSE 仍能稳 定地留存于细胞中且不影响凋亡和坏死的发生,以 上结果同时证明 CFSE 标记不影响细胞的生命活 动。但当 CFSE 标记浓度达到 20 μmol /L 或标记时 间 > 20 min 时,BMSCs 的存活率将会降低,甚至部 分细胞出现死亡。故在 CFSE 对 BMSCs 标记率都达 到 100% 的前提下,本研究选择 CFSE 较低的作用浓 度和较短的作用时间,即 10 μmol /L CFSE 标记 15 min,作为 CFSE 标记 BMSCs 的最佳条件,以在达到 CFSE 最佳标记效果的同时保持最佳的细胞活性。


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本文参考文献: 
大鼠骨髓间充质干细胞体外 CFSE 染色标记的实验研究 
陈若霖1 ,朴丰源1 ,李双月1 ,王哲敏1 ,戚 媛1 ,刘 爽1 ,关 怀2 ,金河天3 (1. 大连医科大学 劳动卫生与环境卫生学教研室,辽宁 大连 116044; 2.

 

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