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类器官传代培养全流程及答疑解惑

更新时间:2022-11-30      点击次数:1016

 

准备工作
1.仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、水浴摇床,医用冰箱、-80°冰箱、移液器(一套)。

2.试剂耗材
小肠类器官培养基、小肠类器官缓冲液、类器官传代消化液、硫酸庆大霉素、双抗、基质胶、60mm细胞培养皿、15ml离心管、1.5ml EP管若干、4度冰盒。

 

操作流程
1.类器官操作流程之——样本准备
(1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液B放置2min。


(2)移液抢轻柔吹打基质胶,收集在15ml离心管中,4℃静置10min。(每6-8孔为一组)。



2. 
类器官传代培养之——样本消化

A:类器官数量不足或体积较小时: 离心5min弃去上清,添加适量小肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管,300g离心5min弃去液体进行第3步。

B:类器官数量较多或体积较大时:离心5min弃去上清,添加适量类器官传代消化液D消化2-3min,添加小肠类器官缓冲液终止消化,离心5min弃去混合液,添加适量小肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管,300g离心5min弃去液体进行第3步。


3. 类器官传代培养之——铺板

类器官收集后,添加基质胶重悬,每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中,放置培养箱中10-15min添加500μl小肠类器官培养基。



答疑解惑

 

Q1:类器官培养一代需要多长时间?

A:一般需要5-7天,长得快可3-5天。

Q2: 初始量样本量10*5,活性大于90%,可以培养出多少类器官?

A:培养一代,一般是24孔板的10个孔。

Q3:原代培养中消化下来的细胞是只有干细胞吗?

A:消化下来的细胞包含各个种类的细胞,但是能培养成类器官的只有成体干细胞和肿瘤干细胞,没有干性的细胞在培养过程中不会增殖分化,养的过程会死掉。

Q4:想要CTC培养,需要多少样本量呢?

A:至少50+个CTC,取样时可以多取一些血,CTC细胞占比比较少。

Q5:类器官量多小的时候不需要加消化液?

A:一般是100um以下。

Q6:如果要做药筛需要额外去除基质胶和培养基吗?

A:和传代培养铺板一样,药用培养基稀释就可以。

Q7:类器官培养一定需要基质胶吗?

A:基质胶主要是为类器官提供支撑作用和营养物质,基质胶主要成分有laminin,collagen IV,heparan sulfate proteoglycans。

Q8:取材时为什么剔除脂肪组织?脂肪肝可以做类器官培养吗?

A:脂肪组织影响后续消化分离得到的干细胞纯度,脂肪肝也是可以做类器官培养的,消化前可以多清洗几次,去掉表面脂肪。

Q9:类器官可以直接用细胞系培养吗?

A:用细胞系培养的不能成为类器官,只能称之为细胞球。

 
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