细胞培养的步骤有哪些

　　细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。

　　细胞培养的步骤

　　1、复 苏

　　细胞复苏的原则：快速融化

　　必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

　　实验前准备

　　将水浴锅提前预热至37℃。

　　细胞实验室进行常规消毒，用75%酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

　　在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

　　取出冻存管

　　根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

　　从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

　　迅速解冻

　　迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

　　约1-2min后冻存管内液体溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

　　平衡离心

　　用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

　　制备细胞悬液

　　吸弃上清液。

　　向离心管内加入适量培养液，吹打制成细胞悬液。

　　用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。

　　细胞计数

　　细胞浓度以5×105/ml为宜。

　　培养细胞

　　将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5%CO2的培养箱内2-4h(或者24-48h)后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。

　　记录复苏日期

　　2、传 代

　　01、传代密度过高

　　一旦细胞养太久至融合度过高(>90%)才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。(如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象)。

　　解决方案

　　尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

　　细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。

　　02、传代密度过低

　　哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

　　解决方案

　　细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。

　　3、冻 存

　　细胞冻存的基本原理：慢冻

　　手动降温：将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。

　　程序降温盒：是一般广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热)，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜)，然后移至液氮中保存。

　　由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。

　　部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但它们也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，血清是用来降低细胞毒性的，但血清也不是完整的。