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细胞培养的步骤有哪些

更新时间:2022-12-01      点击次数:1317
  细胞培养也叫细胞克隆技术,在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术,还是其中之一的生物克隆技术来说,细胞培养都是一个不可少的过程,细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。
  细胞培养的步骤
  1、复 苏
  细胞复苏的原则:快速融化
  必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
  实验前准备
  将水浴锅提前预热至37℃。
  细胞实验室进行常规消毒,用75%酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面,保证无菌。
  在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。
  取出冻存管
  根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。
  从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
  迅速解冻
  迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。
  约1-2min后冻存管内液体溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。
  平衡离心
  用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3分钟。
  制备细胞悬液
  吸弃上清液。
  向离心管内加入适量培养液,吹打制成细胞悬液。
  用培养液悬液混悬沉淀细胞,细胞计数调整细胞浓度,放入培养箱中培养。
  细胞计数
  细胞浓度以5×105/ml为宜。
  培养细胞
  将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱内2-4h(或者24-48h)后换液继续培养培养,换液的时间根据细胞情况而定。
  记录复苏日期
  2、传 代
  01、传代密度过高
  一旦细胞养太久至融合度过高(>90%)才传代,容易使细胞产生老化现象,甚至是堆叠,再消化细胞时不易吹打成单颗细胞,即便再重新铺盘传代,细胞也无法回到原本的特性了。(如:单层细胞,没长满就发生堆叠现象)。
  解决方案
  尽量避免融合度过高,镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
  细胞融合度:在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。
  02、传代密度过低
  哺乳动物贴壁培养细胞,若细胞培养到80-90%密度需要开始传代,在传代接种细胞密度过低,细胞间距离太远,就无法在细胞间产生黏附及通信作用,帮助信号传导并活化细胞;总体细胞量不足,分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境,以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。
  解决方案
  细胞传代时,要进行准确的细胞计数,确保铺盘的密度。
  3、冻 存
  细胞冻存的基本原理:慢冻
  手动降温:将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。
  程序降温盒:是一般广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜),然后移至液氮中保存。
  由此可以看出,程序降温精准度更高,优于手动降温。
  部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞,但它们也会引起细胞毒性,尤其是在室温下。因此,在标准的自制冻存液中,会含有血清,血清是用来降低细胞毒性的,但血清也不是完整的。
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