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类器官实操大本营之——固定包埋

更新时间:2023-01-13      点击次数:734

Q

1、类器官收集

A

收集生长至较大尺寸类器官:96孔板,生长密度较大时,使用移液枪取半孔以上,清洗1至3遍,洗去大部分基质胶,离心沉淀,弃除大部分上清。

Q

2、琼脂糖固定槽制备(可一次制备一批,温密闭保存)

A

1)称量0.2至0.4g琼脂糖,加入至烧杯或者小试剂瓶内;

2)加入10mL左右PBS;

3)微波炉高火融化,每隔5s暂停打开,观察,重复数次至琼脂糖融化;

4)取约200uL融化琼脂糖,加入至600uL EP管内;

5)在盛有琼脂糖的小EP管内插入一小PCR管,使琼脂糖形成一圆尖底凹槽,室温或者4℃冰箱静置数分钟,至琼脂糖凝固,轻轻转动小PCR管,取出PCR管,可看到琼脂糖内形成一个深圆尖底槽。

Q

3、类器官固定

A

1)将类器官轻轻吸出转移至一固定槽底部;

2)轻轻加入PBS至高于琼脂糖槽的边缘;

3)盖上盖子,水平离心机1000 rpm,离心5min;

4)轻轻吸出除底部类器官沉淀外的PBS上清;

5)加入融化的琼脂糖液体200μL;

6)室温静置至琼脂糖凝固;

7)剪去固定管的底部和盖子,置于2 mL EP管内,加入多聚甲醛至差不多装满整个EP管,置于4℃冰箱过夜。

Q

4、类器官包埋

A

1)脱水:取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块,在梯度乙醇中脱水,70%、80%、90%、95%乙醇各1h,100%乙醇30min,待其凝固。

2)融蜡:提前4h左右打开烘箱,65℃溶蜡。

3)透明:将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中(二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中),将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次。

:因二甲苯有毒性,需在通风良好区域进行操作,取出时尽量沥尽残留二甲苯。

4)浸蜡:透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中,60℃浸蜡2h后,更换新的蜡缸再次浸蜡2h。

5)包埋:包埋在冰盒上进行,将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处,将琼脂块放置于中间位置,然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块凝固后,小心脱下模具。

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