RNA分离解决方案，值得信赖！

随着分子生物技术在生物学、医学等方面的广泛应用，RNA提取已成为研究基因表达、克隆目的基因等的一项基本试验技术。高质量RNA的提取，是后续RT-PCR、qPCR、Northern blot、cDNA文库构建等正常进行的必要前提。Trizol法是一种常见的提取总RNA的方法，在RNA得率及试剂成本方面具有一定的优势。

图1 Trizol法提取RNA流程

Trizol是一种较为流行的总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶，因此对于纯化RNA及标准化RNA的生产来说使用价值相对比较高。

图2

♦ Trizol是动植物细胞、组织或者细菌的总RNA抽提试剂；

♦ 主要含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。苯酚主要用于裂解细胞、变性蛋白，同时使部分RNase失活，保护RNA；异硫氰酸胍可降解细胞、溶解蛋白质，使蛋白质的二级结构消失、使核蛋白与核酸分离，进而使核内的RNA被释放出来，并且抑制RNase活性；

♦ 抽提所得RNA无DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为8-2.0；

♦ 裂解细胞或和组织共匀浆时，Trizol可以保持样品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解；

♦ 每一百万细胞用Trizol抽提可得5-15μg RNA；每毫克组织用Trizol抽提可得1-10μg RNA，产量因细胞和组织不同而异；

♦Trizol抽提所得RNA可直接用于Northern，点杂交，纯化mRNA，体外翻译，RNase protectionassay，cDNA克隆，以及RT-PCR；也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。加入氯仿，离心后，样品即分成水样层（RNA存在于水样层）、中间层（DNA和蛋白质存在于中间层）和有机层。

细化它的主要作用点：

（1）作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；

（2）RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；

（3）作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。

异丙醇的作用主要是沉淀RNA。RNA存在于水样层中，收集水样层后可以通过异丙醇沉淀RNA来还原。离心前沉淀不可见，离心弃上清后，可见胶状的RNA沉淀。

75%乙醇主要由乙醇和DEPC水配置，主要用来洗涤粘附在RNA沉淀上的氯仿跟异丙醇。

DEPC处理水是经DEPC（即diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙）处理过并经高温高压灭菌的超纯水（一级水），是一种无色液体。经检测不含杂质RNA、DNA、核酸酶和蛋白质。本产品可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系，以及其它要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。

一、细胞裂解

1、组织样本：

Trizol用量：每50-100mg 组织加1 ml Trizol，样品体积不应超过Trizol体积的10％。

（1）将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理；

（2）将研磨好的组织粉末快速转入装有1ml Trizol的2 ml离心管中，在涡旋振荡器上迅速振荡混匀，置于冰上，待所有的样品研磨完；

（3）裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等，匀浆后仍会存留有不溶物质，可于4℃ 12,000 x g 离心10min，然后吸取上清至一新的离心管中。

2、细胞样本：

（1）贴壁细胞：吸尽培养液，每10cm²培养面积（6孔板单孔或35 mm平皿）加入1ml Trizol，用加样器吹打数次，以确保细胞裂解，然后转移至离心管中。注：Trizol的使用量应由培养皿表面积决定，而非由细胞数目决定。Trizol量不足可能导致提取的RNA中有DNA污染；

（2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每 5-10×10⁶动植物或酵母细胞，或每 1×10⁷细菌细胞加入1ml Trizol，用加样器吹打，使其裂解，然后转移至离心管中。

注：添加Trizol前切勿洗涤细胞 ，以免RNA降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞。

二、液相分离

（1）裂解产物于室温放置5min，使核酸-蛋白复合物分离；（注：此时样品可在-80℃长期保存。）

（2）每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；

（3）4℃ 12,000 x g离心15min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相，中间层和无色的上层水相；

（4）吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用Trizol试剂的60％。

三、RNA回收

（1）按照每1ml Trizol的最初使用量加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10min；

（2）4℃ 12,000 x g 离心10min，弃除上清，可见胶状的RNA沉淀；

（3）按照每1ml Trizol的最初使用量加入1ml 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀；

（4）4℃ 12,000 x g离心5min，弃除上清；

（5）室温倒置5-10min晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免RNA过干，难以溶解）；

（6）加入适量（如25ul）DEPC-ddH₂O或TE缓冲液，用加样器吹打数次溶解RNA；

（7）通过RNA电泳以及紫外分光光度计检测，确定RNA的浓度、纯度和完整性；

（8）所得的RNA应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。

除以上介绍的单品Trizol（abs60154）外，还有Trizol(总RNA抽提试剂盒)（abs9331）包含有RNA提取全流程的试剂。

[1]袁琳, 代亚坤, 高炳淼. 改进 TRIzol 法提取不同发育时期海葵的总RNA[J]. 贵州农业科学, 2020, 48(4): 96.

[2]Eldh M, Lötvall J, Malmhäll C, et al. Importance of RNA isolation methods for analysis of exosomal RNA: evaluation of different methods[J]. Molecular immunology, 2012, 50(4): 278-286.

[3]王华, 李华. 保存动物组织内 RNA 的方法改进[J]. 生物技术通报, 2010 (6): 152-155.

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