类器官与PBMC共培养实验方案，超实用！不信还学不会

最近很多宝宝问类器官如何跟PBMC共培养，这个实验的关键点还是要先养好类器官，可以参照之前的类器官原代培养篇 “ 类器官原代培养全流程 "。

图1 基质胶法构建类器官

那类器官培养成功的标准是什么呢？首先是我们培养的类器官需要稳定传代3代以上，才能表示其干性是比较好的，其次就是要经过组化鉴定，观察其和原组织形态和细胞类型上是否保持一致。经过鉴定后就可以进入我们下一步的实验了，类器官组化的方法跟我们常规组织操作方法是十分类似的，区别就在于类器官的固定上，操作方法小爱也给大家整理好了。详见“类器官实操大本营之——固定包埋"

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图2 类器官组化鉴定

现在就进入我们共培养环节啦！

1、类器官准备

1）提前一周，复苏培养类器官至状态良好；

2）取合适数量类器官，使用预冷PBS清洗数次，去除大部分基质胶；

3）使用培养基重悬类器官。

2、PBMC分离和类器官共培养

1）外周血在无菌环境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集，运输保存；

2）酒精消毒采血管表面，在生物安全柜内打开，将外周血转入无菌15mL离心管；

3）使用Ficoll法分离PBMC；

4）PBMC计数，计算活力与与细胞数；

5）使用培养基（RPMI1640，10%FBS，1%双抗，2mM谷氨酰胺，5ng/mL  IL-4与GM-CSF），悬浮调整至合适浓度，96孔板，每孔约加入5*105 活PBMC，100uL体积；

6）重悬类器官混合液，分别加入等量的样至96孔板中，至总体积200uL。

3、培养观察

1）D0观察记录细胞状态；

2）37℃，5%CO2条件下培养，每日连续观察；

3）D3吸出100uL培养上清，加入100uL新培养基，同时加入（处理抗体或药物）使至终浓度100nM（如果D3已出现显著差别，则记录大视野明场形态，终止实验）；

4）观察至实验组间差异显著，拍照记录大视野细胞明场形态；

5）细胞上清保存用于后续检测。

此图为我司做得免疫共培养实验，从上图可明显看出B药物作用下，T细胞有明显的杀伤效果。

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