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细胞染色专题——荧光染料选择指南

更新时间:2023-03-07      点击次数:1657

细胞培养后,需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行观察。由于细胞小而复杂,若不借助适当的手段,难以观察其形态、结构,更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前,已有多种研究细胞的技术,从光学显微镜到电子显微镜,从一般细胞化学法到免疫化学法。细胞染色是研究细胞生物学特征的一种常用手段,然而,对于细胞实验新手来说,想要获得一张漂亮的细胞染色图并不容易。染色试剂不会选、细胞染色不均匀、染色时切片脱落等都是很常见的问题。今天小爱就为大家整理了几种常用细胞染色方法及染色剂选择指南,快来学习!

表1 几种常用细胞染色方法及特点

染色方法

染色特点及应用范围

革兰氏染色法

一种重要的细菌鉴别染色法,经染色后,阳性菌呈紫色,阴性菌呈红色,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,从而用以分类鉴定。

瑞氏染色法

瑞氏试剂中酸性伊红和碱性美蓝混合经化学作用后,变成中性的伊红化美蓝,久置后,经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞中的NH3+和COO-等结合,使细胞核胞浆着色。由于系中性染料,又有缓冲液调节酸碱度,所以细胞受染后,蓝红等颜色都较适中,核染质、胞浆以及其中颗粒显色较为清楚。

姬姆萨染色法

病理学以及疾病研究中常用的染色剂。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但该法对细胞核寄生虫着色较好,结构显示更清晰,而细胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长,可用复合染色法。

免疫组化染色法

利用抗原抗体之间的特异性结合,用于研究细胞产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移等。

 

了解细胞染色方法后,下面小爱向大家介绍研究不同细胞结构用到的荧光染料。


一、
细胞膜常用染料

DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常见的细胞膜染料(见表2),它们是一族亲脂性的荧光染料,用于细胞的形态学和结构研究。该系列染料进入细胞膜后,会在整个细胞膜上侧向扩散,在最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高,染色均一,荧光不易猝灭,无明显细胞毒性,且受自身荧光背景干扰小。目前DiD已成功应用于多种细胞的体内示踪研究,如Treg细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞、造血干祖细胞等。

表2 细胞膜常用染料及荧光颜色

货号

产品名称

荧光颜色

λEx(nm)/ λEm (nm)

abs47048165

DiD 对氯苯磺酸盐

红色

644/663

abs45153692

DiR 碘化物

深红色

748/780

abs45153674

DiO 高氯酸盐

绿色

484/501

abs42002237

DiI 高氯酸盐

橙色

549/565

 

二、其他细胞结构常用染料

生物染料在细胞结构和组分鉴定中有着广泛的应用,除细胞膜研究外,我们经常也会对一些其它细胞结构及成分进行探索,例如线粒体、溶酶体、蛋白质、细胞核等,而对于不同的细胞结构有不同的染料进行染色,小爱总结如下:


表3常用细胞染料及用途

货号

产品名称

产品用途

abs47047616

DAPI染色液

细胞和组织细胞核染色。

abs47048270

TRITC-Phalloidin

选择性结合丝状肌动蛋白F-actin,用于细胞骨架研究。

abs47047622

台盼蓝染色液(0.4%)

常用于检测细胞膜完整性和细胞存活率

abs47047618

姬姆萨染液

用于染色体、血液、组织切片、原生动物寄生虫等。

abs47047620

Hoechst 33342

标记DNA,也用于细胞核线粒体的显像观察。

abs47047744

JC-10

可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位

abs47014951

吖啶橙盐酸盐

细胞周期研究,细胞培养物和组织模型的凋亡研究。也能用作溶酶体染料,但缺乏特异性。

abs42023979

(+)生物素-N-琥珀酰亚胺基酯

在温和条件下标记蛋白质、肽、细胞器、抗体、寡核苷酸和微珠。


三、细胞染色神器D
API + Phalloidin

DAPI染色液(DAPI Staining Solution)常用于细胞核染色,可将细胞核染成蓝色。鬼笔环肽(Phalloidin)是细胞骨架的染色神器,罗丹明标记的Phalloidin(TRITC- Phalloidin)可将细胞染成橙红色,DAPI与Phalloidin染色液是研究细胞形态变化时经常用到的两种共染的试剂,染色效果可见图1[1]:A1-E1用TRITC-鬼笔环肽(橙红)染色的细胞骨架免疫荧光图;A2-E2用DAPI(蓝色)染色的细胞核免疫荧光图;A3-E3合并的L929细胞免疫荧光染色图。图2[2]是S100A16过表达或下调前后PDAC细胞形态的变化。



注意事项:

※  荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽快检测;
※  避免反复冻融,否则容易失效;
※  DAPI对人体有刺激性,注意适当防护;
※  鬼笔环肽具有毒性,需小心操作(对人的半数致死剂量 LD
50约 2mg/kg)。

 

参考文献

[1] Li J, Chen JN, Peng ZX, et al. Multifunctional Electrospinning Polyhydroxyalkanoate Fibrous Scaffolds with Antibacterial and Angiogenesis Effects for Accelerating Wound Healing[J]. Applied Materials & Interfaces. 2022.

[2] Li T, Ren TY, Huang CM, et al. YS100A16 induces epithelial-mesenchymal transition in human PDAC cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[J]. Biochemical Pharmacology 189 (2021) 114396.


常见问题解答(FAQ)

Question

Answer

Q1:用DAPI和鬼笔环肽染细胞的先后顺序是什么?

一般情况下先用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色20~40分钟,PBS清洗细胞2次,再用DAPI复染10~20分钟。可根据实际染色情况缩短或延长时间。

Q2:用DAPI染细胞核时,整张图片显示蓝色是什么原因?

染色时应注意滴加量不要太多,否则会造成整张图像呈现蓝色背景,只需覆盖上薄薄的一层即可。此外,荧光染料存在淬灭的问题,建议染色后尽快检测。

Q3:DAPI染色中避光的操作到底要多严格才不至于影响结果?

DAPI相对很容易染上色,避光处理时加样等操作短时见光没有关系,但是不操作的时候需要暗盒或锡纸包裹,染色后应尽快检测。

Q4:我的细胞样品转染了带有GFP的质粒,应该选择哪种鬼笔环肽?

可以选择TRITC(橙红)或是Fluor 700(远红)标记的鬼笔环肽。

Q5:鬼笔环肽有好多种,它们的区别是什么?我应该如何选择?

主要是荧光基团的差异,激发不同的荧光颜色,用来区分共染时其他荧光染料的颜色,选择时应满足机器激发和发射波长。

Q6:鬼笔环肽可以染活细胞吗?什么染色剂可以染活细胞?

鬼笔环肽不能直接应用于活细胞的染色,因为它无法穿越细胞膜。DAPI可以透过完整的细胞膜,它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

 

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