分子克隆技术——质粒介绍篇

上期给大家介绍了分子克隆的概念、原理以及通用实验流程，相信大家已经对分子克隆技术应该有一定了解了，详见 “" 。本期小爱将为大家讲解分子克隆的载体——质粒。走！瞅瞅去! 

分子克隆技术运用的载体只要是指将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子工具。常见的载体主要有质粒、噬菌体、病毒等。今天咱们要聊的主角是质粒。

一、什么是质粒？

天然质粒是可独立于染色体外可自行复制的环状DNA分子，通常带有一些基因，特别是一些与抗生素耐药性有关的基因，可以在不同的细菌细胞之间传递。质粒主要存在于细胞、古生菌及真核生物中，比较特殊的在植物的叶绿体和线粒体等胞器中也有出现。

研究报道指出质粒也不全是环状的哦！1984年，在Streptomyces coelicoler（天蓝色链霉菌）等放线菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋体）等原核生物中，又相继发现线形质粒。基于质粒能够携带基因，并且能够在不同细胞中传代基因的特性，质粒被运用到分子克隆技术中。在分子克隆技术中运用的质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工改造得来，通常所用的是细菌载体质粒。

它在分子克隆技术中的运用是将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞（如大肠杆菌）中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

细菌质粒是基因工程中常用的载体，这些质粒至少要有复制起点、筛选标记和克隆位点。基础的部分我们都来详细了解下。

二、质粒结构原件有哪些？

图1 质粒图谱

1）复制起始位点(Origin of Replication，ORI)

ORI是一段DNA序列，质粒复制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于这段序列，然后DNA的双链被分开，复制随即开始。质粒必须是能够复制的，否则随着细菌的生长，质粒的数量将会被迅速稀释。

2）抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Gene)

抗生素抗性基因存在作用是快速筛选。在含有抗生素的培养基中培养细菌，能够生长的就是含有目的质粒，不含质粒的细菌已经被“杀死"了。

3）筛选标记(Selectable Marker)

筛选已经成功摄取质粒的细胞。该筛选标记需要区别于细菌中的抗性筛选。细菌抗性基因筛选用于质粒扩增过程，筛选标记用于筛选或标记转染后的细胞。筛选标记通常是抗性筛选或者荧光蛋白。

4）启动子(Promoter)

启动子是能够使基因进行转录的一段DNA序列。启动子可以被RNA聚合酶辨别，并开始转录。启动子常位于目的基因上游100-1000bp位置处，是质粒非常重要的一个元件，它决定着目的基因可以在何种细胞中进行表达，也决定蛋白质的表达量。

5）多克隆位点(Multiple Cloning Site, MCS)

多克隆位点是一段短DNA片段，包括多个限制性酶切的单一位点，便于外源基因的插入。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。在表达型质粒中，MCS常处于启动子的后面。

6）引物结合位点(Primer Binding Site)

引物结合位点为一小段DNA片段，用来进行质粒的PCR扩增或者测序。

7）插入片段(Inserted Gene)

插入片段又称为外源性基因，是克隆到MCS中的基因、启动子或其他DNA片段，通常是人们所希望研究的遗传元件。

三、质粒的分类有哪些？

1）表达质粒：用于基因表达（基因功能的研究）。表达载体必须包含启动子、转录终止子序列和插入基因。启动子驱动插入DNA转录生成RNA，合成的RNA上的终止子序列发出停止转录过程的信号。表达载体可以通过增强子序列增加蛋白质或RNA的产量。表达载体可以在各种细胞类型（哺乳动物、酵母、细菌等）中驱动表达，这在很大程度上取决于用于启动转录的启动子。

2）克隆质粒：用于促进DNA片段的克隆。克隆载体往往非常简单，通常只包含细菌抗性基因、复制起点和MCS。

3）报告质粒：用于研究遗传元件的功能。这些质粒包含一个报告基因（例如，荧光素酶或GFP），可提供遗传元件活性的读数。AG8亚国服务的快速多片段DNA组装预混液（abs60250）可以直接用于报告基因质粒的构建。同时我们还有一系列的荧光素酶报告基因检测试剂盒：abs60341、abs60342、abs60343、abs60344供大家选择。

4）病毒质粒：通过修饰的病毒基因组，有效地将遗传物质递送到靶细胞中。可以使用这些质粒来制造病毒颗粒，例如慢病毒、逆转录病毒、AAV或腺病毒颗粒，从而高效感染靶细胞。

5）基因敲减质粒：用于减少内源基因的表达。通过表达靶向目的基因mRNA的shRNA来实现。这些质粒具有可以驱动短 RNA 表达的启动子。

6）基因工程质粒：用于靶向和编辑基因组。通常使用CRISPR技术完成。

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