给您一双鉴别支原体污染的慧眼

很多小伙伴都疑惑，细胞被支原体污染后的特征是什么？如何鉴别细胞被支原体污染了？今天，我带大家分享两个支原体污染的案例，共同探寻一下细胞被支原体污染后的特征。

图1 感染支原体的EBTr（牛胚气管细胞）

先来观察一下被支原体污染的牛胚气管细胞（图1），由成纤维样逐渐变得类上皮样；质膜铺展，溃烂；轮廓不清，边界模糊。再看右图，细胞处于边增殖边凋亡的状态，漂浮凋亡细胞过多。

图2 感染支原体的HT1080（人纤维肉瘤细胞）

接下来再观察一下被支原体污染的人纤维肉瘤细胞HT1080（图2），由上皮样逐渐变得类成纤维样，胞体细长，和前面的牛胚气管细胞形态变化刚好相反；伪足伸长，出现明显的拉丝现象，表明细胞可能在“痛苦"地迁移。使用了支原体杀除试剂（abs9375），清除了支原体以后，如右图所示，细胞逐渐恢复了上皮样形态，拉丝减少。

图3 细胞膜上的支原体集落

接下来，给大家展示贴附在细胞膜上的支原体集落（图3），支原体是目前已知最小的原核生物，直径大小在0.1-0.3um，比细菌还要小。支原体可在培养液、细胞膜、细胞内增殖。单个支原体需要借助于电镜才可以观察到具体形态，图中膜上的黑点为支原体集落。细胞背景干净，形态没有大的变化，但质膜粗糙，布满黑点。

总结下来，细胞被支原体污染的主要特征如下：

✔ 增殖减慢；

✔ 上清液澄澈；

✔ 背景干净；

✔ 细胞形态异常（拉丝、铺展）；

✔ 更换新的培养液细胞状态没有恢复。

细胞被支原体污染后的共性表现为细胞增殖减慢、上清液澄澈、背景干净，这3点可以明确地排除真、细菌污染。值得一提的是，当给细胞的营养体系不佳时，细胞也会表现出形态异常，所以，我们可以给细胞更换新的培养液，如果细胞也没有恢复正常形态，此时判断细胞极有可能被支原体“附身"了。

上述的判断方法需要丰富的经验积累，日常细胞培养中，我们还可以用PCR扩增试剂盒检测细胞是否有支原体污染。

图4 支原体检测试剂盒（PCR法）

产品优势： ✔ 本试剂盒检测灵敏度高，可检测低至20个拷贝的支原体； ✔ 实验时间短，3小时即可完成； ✔ 已在多个支原体品种上做过验证。

表1 产品组分表

该试剂盒检测到的支原体类别主要有：

M.fermentans（发酵支原体）、M.hyorhinis（猪鼻支原体）、M.arginini（精氨酸支原体）、M. Orale（口腔支原体）、M.hominis（人型支原体）、M.bovis（牛支原体）、M.pneumoniae（肺炎支原体）、M.pirum（梨支原体）、M.gallisepticum（鸡毒支原体）、Ureaplasma spp（解脲支原体）、A.laidlawii（莱氏无胆甾原体） 等11种以上支原体。

作用原理：

试剂盒使用的混合引物是针对支原体16s rRNA序列的保守区域设计的特异性引物，可直接使用细胞培养液作为PCR模板，特异性扩增支原体DNA。

支原体检测试剂盒（PCR法）使用方法

1、样品准备

取适量待检细胞培养上清于洁净的PCR管中（如果是血清样本，可用 Mycoplasma Free Water 稀释），利用PCR仪95℃热处理5min后作为模板；

2、PCR体系配制

每次实验需设置阴性对照（将1μL待检样品换成等量的Mycoplasma Free Water）与阳性对照（在1μL待检样品中加入0.5μL Positive Control后一起作为Template），实验时戴一次性口罩与手套，谨慎操作，防止操作不当引入外源支原体污染；

3、PCR程序设置

表2

4、凝胶电泳

取10μL PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；

5、结果分析

每次实验通过与阴性对照、阳性对照检测结果比较确认样品支原体污染情况，阳性条带大小500bp左右。如阴性对照检测结果中有条带很有可能是PCR体系中出现污染，建议重新实验确认结果。如有必要，也可对PCR产物进行常规测序，以确定具体的支原体种属。

如果您的细胞真的“中镖"了，也不要怕，我们的支原体杀除试剂为您的细胞披荆斩棘，保驾护航。

产品优势：
✔ 特异性清除培养基中的支原体；

✔ 只需要3-6天，便可以有效清除支原体；

✔ 活性成分为多肽类，不会产生耐药性；

✔ 对细胞几乎无毒性，在100多种细胞上进行过验证，包括但不限于 HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；

✔ 广谱性，可替代双抗，可以清除常见的革兰氏阴性和阳性菌；

✔ 可直接加入血清、培养基中，用于清除支原体污染；

使用方法：
1、收到货后，将试剂管瞬时离心（3000rpm，3～5s）保存。
2、推荐稀释比例为1:1000。例如10mL的培养基加入10μL的Treatment混匀。
3、弃去旧的培养基，用PBS将细胞清洗干净，再加入含有支原体清除剂的新鲜培养基，1天1次， 连续处理3天；或者2天1次，连续处理5～6天。若细胞污染非常严重时，需延长处理时间。
4、若细胞对支原体清除剂敏感，或生长明显被抑制时，请参考以下推荐参数。

表3

5、处理完毕后，加入新鲜培养基，培养基中可添加支原体预防剂（abs9376）预防支原体再次污染。

本期讲解就到这里了，如有细胞培养问题，欢迎微信公众号后台留言，或者扫描下方二维码加入我们微信群交流~

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