多重荧光免疫组化Q&A（第一弹）

Q1：我想要进行多色实验，对于我的样本有什么要求吗？
A1：您按照免疫组化的标准对您的样本进行前处理即可。如果是从历史切片或者蜡块中挑选用来做多色，请尽量选取相对较新的样本（一个月内），最长不要选保存超过半年的样本，可能会有靶点缺失或者强非特异性，导致染色效果欠佳。

附上石蜡切片样本处理推荐：

1）取新鲜组织（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的组织过大，需要切小后再做固定，以免组织太厚固定液渗透不良，导致后续染色效果不佳；

2）组织离体后（不要超过30分钟）迅速转移到固定液中（一般选用10%中性福尔马林或4%多聚甲醛），在常温条件下固定时间为18-24小时，不要固定太长时间，容易导致组织抗原丢失，影响阳性信号显色；

3）浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，容易导致后续染色过程中组织脱片；

4）切片厚度最佳为4微米，组织太厚容易导致染料渗透不加，且多层细胞之间荧光发生串扰，影响成像观察。贴片需选用免疫组化专用的防脱载玻片，不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，捞片后竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片；

5）切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右，到干片为止，否则后续染色过程中易脱片。但需要注意温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，因为在高温干燥条件下会加速组织切片中抗原的氧化。
 

Q2：如果我的样本是冰冻切片或者细胞爬片，可以用来做多色实验吗？
A2：可以的，多色实验本身不局限您的样本类型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否经得起多轮抗体洗脱，在样本不脱片的情况下，才能有一个比较好的染色效果。如果您是这类样本，您需要额外准备一瓶抗体洗脱液（abs994），替代多色实验中的热修复步骤，采用温和的洗脱方式，避免高温高压破坏切片。需要注意的是，您依旧需要控制切片厚度，尽量保证在单层细胞的厚度，如太厚，多层细胞之间发生重叠，荧光信号会发生串扰。（PS：石蜡切片是比较适合做多色实验的样本类型！）


Q3：我该如何选择用于做多色的抗体呢？
A3：多色这项技术比较突出的一个优势就在于对一抗种属没有特殊的限定，根据样本种属选择即可，我们试剂盒本身配备了二抗（鼠兔通用二抗或者抗兔二抗），您在选取一抗来源的时候，尽可能选择兔子或者小鼠来源的一抗，如确实找不到鼠或兔来源的一抗也没有关系，您只需要再准备一个跟该一抗来源适配的能用于免疫组化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能应用于IHC，并且尽量选择单克隆抗体，多抗往往容易产生非特异性。


Q4：我注意到你们多色试剂盒中也是荧光染料，我在操作过程中需要额外避光吗？
A4：不用的，您在常规日光灯环境下操作就可以，我们染料的荧光强度很高，不会那么容易淬灭，但涉及到需要孵育或者保存的时候还是建议您采用避光湿盒进行。


Q5：我今天做好了多色片子，但无法立即进行扫描观察，我该怎么保存呢？
A5：染好的多色片子可以避光在4℃条件下保存较长的时间，但我们建议您完成染色以后，在两周内完成成像，并且如果需要长时间保存，建议您用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。如保存时间过长，或保存不当，封片剂容易干掉，此时再成像会有较强非特异性，可以使用PBS把盖玻片洗下来，重新封片以后再观察，但成像效果依旧会打折扣，还是建议您尽快完成成像。（PS：虽然荧光染料没有那么容易淬灭，但若多次成像反复激发，依旧会淬灭，2-3次影响不会很大，但不排除偶然性哦）


Q6：整个多色实验一般需要多久能够完成呀？一天能行吗？
A6：如果您的指标比较少（2~3个指标），恰好您又是“肝帝"愿意熬夜做实验，那么一天是可以做完的哦，因为我们多色染料有信号放大的功能，且试剂盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信号，因此原本需要4℃过夜的一抗孵育，可以在室温1小时，或者37℃烘箱一小时完成，满打满算一天是可以做完实验的。但如果您不想要这么“肝"，当然可以，您只需要在一抗孵育的步骤选择4℃过夜，第二天再来继续做二抗孵育等后续操作就行，跟您做IHC实验一样，当您指标比较多的时候，可以合理安排，部分抗体室温1小时，部分抗体4℃过夜，但也不可把“战线"拉得太长，控制在尽可能短的时间完成实验，毕竟迟则生变哦。

还在为搭配不同种属一抗而发愁？
还在为指标太多而苦恼？
Absin多色技术来啦！打破一抗种属限制！实现同片最高9标10色！

★ Do It Yourself！多色试剂盒买就送！★

买 20T 试剂盒送2瓶一抗二抗稀释液（abs9299-100ml）；
买 100T 试剂盒送1支 50ul 人用病理抗体！

★ Flash Service！您有样本，我有抗体！★

Absin精选抗体库，自由组合panel!

Absin特色产品线：

WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...