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Q1：我该如何得到很好的多色结果呢？
A1：首先，您需要有质量不错的样本和抗体，这就已经是成功的一半（样本、抗体选择攻略），对于样本来说，脱片是我们需要预防的“头号公敌"，多色实验需要重复热修复洗脱抗体多次，假如片子脱片，轻则成像模糊，重则组织脱落前功尽弃，可以在开始实验之前先模拟几轮热修复，不加抗体和其他试剂，看看组织是否有脱落的迹象，如果脱落比较严重，则需要重新制备切片，如果有轻微脱片，则可以考虑购买抗体洗脱液（abs994），替代热修复的过程；然后，就可以开始做实验了，我们建议您*行抗体和染料工作条件摸索，再上多染（参考下图流程），这样多染的成功率可以达到90%以上哦！（小爱经验之谈，即便是染了千百遍的常见指标，换个样本，染色效果就可能天差地别，有条件还是建议要做预实验。）
最后的10%，就需要调整指标与染料搭配以及染色的顺序了。
Q2：有没有推荐的染料搭配和染色顺序呢？
A2：染料搭配一般遵循“寡靶配强光，众靶配弱光"的原则，意思是表达比较弱的指标搭配荧光信号比较强的染料，表达相对强的指标搭配信号比较弱的染料，Absin的TSA染料波长越短荧光强度越强，比如说需要染PD-1，CD8和CD3，我们手里有一个四色试剂盒（TSA520/TSA570/TSA650），通过IHC发现样本中PD-1的信号很少，CD3信号非常多，其次是CD8，于是选择TSA520搭配PD-1，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比较合理。
接下来就是怎么安排染色先后顺序：
1）划分细胞定位，先外后内：确定每个指标的细胞定位，膜表达先染，胞浆或者胞核的后染（如果是指标比较多的情况下，胞内指标排在比较后面，经过前期多轮洗脱，可以不做细胞通透；如果指标很少，染胞内指标之前还是需要打孔，多个胞内指标也只需要打一次孔）；
2）确定抗原修复方式，先酸后碱：碱修复比酸修复的力度会更强，个别抗体在用碱修复以后会染出来很多非特异性，所以如果是相同的细胞定位，就先染酸修复，再染碱修复的抗体；
3）根据IHC结果判别，先弱后强：组化结果显示指标比较少，比较弱的，排在前面染，理论上来说越靠前染的指标效果会越接近单标染色。
以上就是一些通用规则，但不同的指标还是可能出现变化，要想得到较好的结果，就需要不同的排列组合一个一个尝试（如下表，“X"代表有信号），这样会比较耗费时间和试剂，您可以根据通用规则先行一次多染，然后各通道跟荧光单染做对比，如果效果差别很大，那就再调整染色顺序，如果单染的结果跟组化差别比较大（出现高背景，非特异性明显），就要考虑更换染料搭配。
Target | Best Signal | Recommended | ||
1st AR | 3rd AR | 6th AR | ||
FOXP3 |
|
| x | 1:250 |
PD-1 | x |
|
| 1:250 |
LAG3 |
| x | x | 1:250 |
CD4 |
| x | x | 1:250 |
Q3：我成像完了以后想要做数据分析，你们有什么软件推荐吗？
A3：目前市面上数据分析软件还是比较多的，像免费的您可以下载imageJ、Qupath，缺点就是用法都需要您自行摸索；我们公司安装的是HALO和StrataQuest两款软件，HALO是付费的，StrataQuest是我们TG的扫描仪平台自带的，从功能、分析的精准度和可操作性来说，肯定是大大优于开源软件的，且有软件专业的技术支持团队能够答疑解惑。您可以根据您的实际情况选择合适的分析软件，如果您实在无从下手，也可以找Absin，我们可以提供数据分析的服务~
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角蛋白（CK）相关抗体 | panCK、CK-4、CK HMW、CK-1、CK-10、CK-14、CK-17、CK-18、CK-19、CK-20、CK-5、CK-5&6、CK-6、CK-7、CK-8、CK-8&18 |
癌症肿瘤相关 | p120、p16、p21、p40、p53、p63、AFP、ALK、AMACR、ANXA1、Aurora-B、Bcl-6、CTNNB1、CA125、CDK4、CDX2、CEA、CCND1、c-MET、c-Myc、DOG1、CDH1、EGFR、EpCAM、ERG、EZH2、FABP3、FGFR2、FOXP1、GATA-3、GCDFP-15、GPC3、GZMB、HER-2、IDH1 R132H、Ki-67、LDLR、MCM7、MCM3、MGMT、MSH2、MSH6、MUC1、MUC2、MUC4、MUM1、MyoD1、Myogenin、Myosin (Smooth Muscle)、Napsin-A、N-Cadherin、Olig2、PAX-2、PAX-5、PAX-8、PCT、PD-1、PHH3、PLAP、PMEL-17、PDPN、PR、PSA、PSAP、S100A1、S100P、SALL4、SATB1、SF-1、SOX10、SOX11、SOX2、STAT6、Stathmin、TCL1、TFE3、TG、TLE1、TOP2A、TPO、TRPS1、TTF-1、Type I Cytokeratins、Type II Cytokeratins、Uroplakin III、Villin、WT1、ZAP-70 |
神经相关 | ATRX、p75 NGF Receptor、CgA、DDX4、GFAP、λLight Chains、MBP、NeuN、Neurofilament、NSE、Olig2、p75 NGF Receptor、S100、SYP |
血管 | ACE2、VEGF、VWF |
钙蛋白 | CALB1、Caldesmon、Calponin、Calcitonin、Calprotectin |
其他 | MPO、AR、Arg-1、AR-V7、B2M、CLDN1、Collagen Type Ⅳ、COL4A5、ERα、GH、HBSAg、hCG、hCG-beta、hPL、IgD、IgG、IgM、IGFBP3、Insulin、Oct3/4、SCGN、Somatostatin、TDT、Actin、Desmin |
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