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多重荧光免疫组化Q&A(第三弹)

更新时间:2023-05-09      点击次数:574

Q1:我该如何得到很好的多色结果呢?

A1:首先,您需要有质量不错的样本和抗体,这就已经是成功的一半(样本、抗体选择攻略),对于样本来说,脱片是我们需要预防的“头号公敌",多色实验需要重复热修复洗脱抗体多次,假如片子脱片,轻则成像模糊,重则组织脱落前功尽弃,可以在开始实验之前先模拟几轮热修复,不加抗体和其他试剂,看看组织是否有脱落的迹象,如果脱落比较严重,则需要重新制备切片,如果有轻微脱片,则可以考虑购买抗体洗脱液(abs994),替代热修复的过程;然后,就可以开始做实验了,我们建议您*行抗体和染料工作条件摸索,再上多染(参考下图流程),这样多染的成功率可以达到90%以上哦!(小爱经验之谈,即便是染了千百遍的常见指标,换个样本,染色效果就可能天差地别,有条件还是建议要做预实验。)



最后的10%,就需要调整指标与染料搭配以及染色的顺序了。

 

Q2:有没有推荐的染料搭配和染色顺序呢?

A2:染料搭配一般遵循“寡靶配强光,众靶配弱光"的原则,意思是表达比较弱的指标搭配荧光信号比较强的染料,表达相对强的指标搭配信号比较弱的染料,Absin的TSA染料波长越短荧光强度越强,比如说需要染PD-1,CD8和CD3,我们手里有一个四色试剂盒(TSA520/TSA570/TSA650),通过IHC发现样本中PD-1的信号很少,CD3信号非常多,其次是CD8,于是选择TSA520搭配PD-1,TSA650搭配CD3,TSA570搭配CD8,比较合理。

接下来就是怎么安排染色先后顺序

1)划分细胞定位,先外后内:确定每个指标的细胞定位,膜表达先染,胞浆或者胞核的后染(如果是指标比较多的情况下,胞内指标排在比较后面,经过前期多轮洗脱,可以不做细胞通透;如果指标很少,染胞内指标之前还是需要打孔,多个胞内指标也只需要打一次孔);
2)确定抗原修复方式,先酸后碱:碱修复比酸修复的力度会更强,个别抗体在用碱修复以后会染出来很多非特异性,所以如果是相同的细胞定位,就先染酸修复,再染碱修复的抗体;
3)根据IHC结果判别,先弱后强:组化结果显示指标比较少,比较弱的,排在前面染,理论上来说越靠前染的指标效果会越接近单标染色。

以上就是一些通用规则,但不同的指标还是可能出现变化,要想得到较好的结果,就需要不同的排列组合一个一个尝试(如下表,“X"代表有信号),这样会比较耗费时间和试剂,您可以根据通用规则先行一次多染,然后各通道跟荧光单染做对比,如果效果差别很大,那就再调整染色顺序,如果单染的结果跟组化差别比较大(出现高背景,非特异性明显),就要考虑更换染料搭配。

Target

Best Signal

Recommended
Dilution

1st AR

3rd AR

6th AR

FOXP3

 

 

x

1:250

PD-1

x

 

 

1:250

LAG3

 

x

x

1:250

CD4

 

x

x

1:250


Q3:
我成像完了以后想要做数据分析,你们有什么软件推荐吗?

A3:目前市面上数据分析软件还是比较多的,像免费的您可以下载imageJ、Qupath,缺点就是用法都需要您自行摸索;我们公司安装的是HALO和StrataQuest两款软件,HALO是付费的,StrataQuest是我们TG的扫描仪平台自带的,从功能、分析的精准度和可操作性来说,肯定是大大优于开源软件的,且有软件专业的技术支持团队能够答疑解惑。您可以根据您的实际情况选择合适的分析软件,如果您实在无从下手,也可以找Absin,我们可以提供数据分析的服务~

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钙蛋白

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