细胞培养用“胰蛋白酶” or “胶原蛋白酶”？

在进行细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织等进行处理，或用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞即原代培养。在进行传代培养时，贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个的细胞。那么“胰蛋白酶"和“胶原蛋白酶"到底有什么区别呢？我们在细胞培养时应该如何选择？

尽管胰蛋白酶和胶原蛋白酶都是细胞培养中常用于将体积较小的组织块分散成细胞团或单细胞的消化液，但它们的作用机制及适用情况并不相同。

一、胰蛋白酶的作用特点

胰蛋白酶分离自牛、猪等动物的胰，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽链，除去细胞间黏蛋白及糖蛋白，从而使细胞分离，是应用广泛的消化物，适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织以及传代细胞等。胰蛋白酶的消化作用与酶的浓度、pH、温度、组织块的大小以及组织的硬度都有关系。胰蛋白酶浓度过大或消化时间太长，会导致细胞被消化；但反之消化不充分也达不到分散细胞的目的。此外，血清明显抑制胰蛋白酶的活性，Ca²⁺和Mg²⁺对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。

根据细胞类型和实验目的，可选用含/不含EDTA或酚红的胰蛋白酶，其作用如下：

EDTA（乙二胺四乙酸）：胰蛋白酶中的EDTA主要起到螯合金属离子，使细胞更容易分散的作用。 EDTA可以螯合Ca²⁺ 或Mg²⁺，而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca²⁺ 或Mg²⁺的，把这些离子螯合后，可以加速细胞和培养皿的脱离，促进消化。EDTA是2价阳离子螯合剂，所以能螯合钙、镁等离子。上皮类细胞的连接存在“桥粒"结构，是细胞间最“牢固"的连接，但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时，加入EDTA，可以破坏细胞的桥粒结构，使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说，就是破坏细胞间的粘连。

酚红：胰蛋白酶中的酚红主要是起到PH指示剂的作用。胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH范围内实现。在此范围内的酚红呈粉红色。由于环境条件，胰蛋白酶的pH可能变为酸性，呈橙色并使胰蛋白酶的效果降低。使用NaOH调节pH至7.4-7.6可以优化胰蛋白酶活性。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

浓度：一般常用胰酶的工作浓度为0.25%，而半贴壁细胞或对胰酶敏感的细胞常采用低浓度（0.05%）的胰酶进行细胞消化。

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贴壁细胞消化实验方案：

（1）吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。

（2）加入少量胰蛋白酶消化液，盖过细胞即可，室温放置1-2分钟。不同的细胞消化时间有所不同，对于贴壁牢固的细胞可适当延长消化时间。

（3）显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。此时吸除消化液。加入含血清的细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。

（4）如果发现消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

（5）如果发现细胞消化时间过长，未及时吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

组织的消化：不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。

二、胶原蛋白酶的作用特点

胶原蛋白酶是能在一定的pH和温度下切割胶原蛋白主体螺旋多肽链的酶类，主要用于水解结缔组织中的胶原蛋白，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。当拟消化的组织较硬，内含较多的结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞效果较差，可采用胶原酶解离细胞法。钙、镁离子以及血清不会影响胶原酶的消化作用，其消化作用缓和，且无需机械振荡。

目前商业化的胶原酶因所含组分的差异分为五类，其在应用上具有一定区分：

（1）胶原酶Ⅰ型：含有比较均匀的各种酶活力（包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备。

（2）胶原酶Ⅱ型：比I型胶原酶含更高的梭菌蛋白酶活性，通常用作心脏、骨、肝、甲状腺、唾液腺和软骨等组织的原代细胞制备。

（3）胶原酶Ⅲ型：含较低的次级蛋白酶污染物水解活性，但具典型的胶原酶活性。常用于乳腺组织的原代细胞制备。

（4）胶原酶Ⅳ型：含较低的胰酶活性以降低对膜蛋白和受体的损害，通常用于胰岛细胞制备，和维持受体完整性比较重要的其他研究，也可用于髓系细胞制备。

（5）胶原酶V型：含更高的胶原酶和酪蛋白活性，更低胰酶水平以降低对膜蛋白和受体造成损伤。适用于胰岛制备。

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