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体外诊断业的宠儿——游离DNA

更新时间:2023-05-25      点击次数:777

随着2015年精准医疗计划的提出,液体活检技术备受关注。液体活检常见的三种有效素材主要有:游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)和外泌体。


图1 液体活检方案。人体血液中含有细胞、胞外膜囊泡(EMVS)、游离DNA(cfDNA)、游离RNA(cfRNA)和蛋白质,可作为各种疾病的生物标志物

 

一、什么是游离DNA?

游离DNA又称循环DNA、无细胞DNA,是指存在于血浆、血清或尿液等体液中的细胞外DNA。循环肿瘤DNA是指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段,是肿瘤患者cfDNA的一种。最早在1948年,Mandel次在人类血液中检测到存在cfDNA,但当时并没有引起科学界的关注。直到1977年,Leon等报道了肿瘤患者外周血中存在较高水平的cfDNA,随后众多学者开始了肿瘤患者外周血中cfDNA研究。1997年,香港的卢煜明教授运用PCR技术,在孕妇的血浆中扩增了Y染色体特异性片段,证明怀有男胎的孕妇血浆中存在胎儿cfDNA,从而为无创产前筛查奠定了基础。

关于cfDNA的产生来源,目前普遍认为细胞主动释放、细胞发生凋亡、细胞坏死释放的DNA片段是cfDNA的主要来源。一般来说,癌症患者的正常循环cfDNA水平比健康人高得多。因为随着肿瘤体积的增大,细胞的更新也随之增加,凋亡和坏死细胞的数量也随之增加。在正常的生理情况下,凋亡和坏死的残留物可通过浸润的吞噬细胞清除。但这不能有效地发生在肿瘤肿块内,导致细胞碎片的积累不可避免地释放到循环中使cfDNA浓度显著升高。


图2 游离DNA的主要来源

 

cfDNA大部分为双链DNA分子,其片段分布与核小体的结构有关,每个核小体单位包括一个组蛋白八聚体、DNA分子及一分子H1;组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构,146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈,组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA,锁住核小体DNA的进出端,起到稳定核小体的作用。因此cfDNA长度主要集中在80-300bp,峰值位于166bp左右,且存在10.4bp的波动。cfDNA在健康个体中通常浓度很低,血浆cfDNA被认为主要来自造血系正常细胞的凋亡,其他组织的贡献很小。并且cfDNA的半衰期很短,仅1-2小时,不稳定易降解。

相比于组织而言,检测cfDNA具有三大优势

✦ 可及性:cfDNA容易获取,且可以反复取样;
✦ 全面性:可全面反映肿瘤组织的异质性;
✦ 实时性:可实时动态监测疾病的状态(如耐药方面),因此cfDNA检测逐渐成为体外诊断应用方面的宠儿。


图3 cfDNA的结构


图4 常规测序文库制备测定cfDNA的片段长度

 

二、游离DNA应用实例



图5 cfDNA的应用

 

1、无创产前筛查(NIPT

基于1997年卢煜明教授及其团队发现孕妇的血浆内存有高浓度的胎儿DNA,他们研发推出了唐氏综合征的无创检验方法—NIPT(noninvasive prenatal testing),迅速被超过90个国家所采用。NIPT即无创性胎儿染色体非整倍体检测,也称无创产前DNA检测,在临床上主要用于唐氏综合征的筛查。通过采集孕妈妈外周血,从中提取游离DNA(包含妈妈和宝宝DNA),来分析宝宝的染色体情况。但以目前的医疗水平还不能治愈唐氏综合征,所以加强孕期产检,减少唐氏综合征患儿的出生十分重要。


图6 NIPT检验流程

 

2、肿瘤相关分析

无需有创肿瘤活检,而是直接从常规抽血中分析来自肿瘤的DNA,cfDNA分析在癌症发展、诊断和治疗的整个自然过程中具有多种潜在应用。Web of science引文报告显示:2017年与2018年间与cfDNA研究有关的文章,51%聚焦于肿瘤方面,由此可见cfDNA在肿瘤方向的应用火热。2016年6月1日,FDA批准适用于血液cfDNA检测的,用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的基因检测试剂盒,这是作为cfDNA应用于肿瘤伴随诊断、药物疗效监测的批准。同时Nitzan等于nature reviews cancer杂志上发表名为“Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA"的文章表明ctDNA可用于耐药突变及新发突变分析。


图7 ctDNA可用于耐药突变及新发突变分析应用

 

2020年发表于Nature杂志上的一篇文章,研究者对早期的肺癌患者治疗前血浆中ctDNA的含量进行检测研究,发现在一定时间内(监测100个月)肺癌患者治疗前ctDNA高的病人复发率以及远处转移率均高于ctDNA含量低的病人,因此ctDNA对于肿瘤的监测及预后方面具有一定积极意义。


图8 cfDNA在肿瘤动态监测及预后方面的应用

 

Jay Shendure等于Cell杂志上发表的文章利用癌症患者的ctDNA样本进行测序,发现不同的癌症类型可以ctDNA上产生不同的核小体的指纹。因此对于某些癌症患者而言,研究者可以利用ctDNA鉴别肿瘤的组织学来源。


图9 ctDNA可以用于分析肿瘤组织来源(在癌症溯源方面应用)

 

由复旦大学金力院士牵头的癌症早筛研究结果于2020年发表于Nature Communication杂志,该研究采用PanSeer癌症早筛技术,通过检测cfDNA甲基化状态实现多癌种筛查,可提前4年发现癌症患者血液中的甲基化信号,实现癌症早筛的功能。


图10 cfDNA在癌症早筛中的应用

 

3、微生物感染诊断

与传统微生物检测相比,微生物游离DNA(mcfDNA)检测阳性率更高,mcfDNA目前已在临床感染的诊治中发挥了重要作用,如脓毒症、社区获得性肺炎、结核病、侵袭性真菌病、尿路感染等。

Blauwkamp等人于Nature Microbiology上发表的血浆mcfDNA高通量测序研究中表明:临床纳入348例疑似脓毒症患者,与阳性的血培养相比,其阳性符合率为93.7%。在出现症状前出现抗菌药物的患者中,NGS检出可靠或者确定的病原比例为47.9%,血培养灵敏度为19.6%,由此可见mcf检测微生物感染的优势。

 


图11 微生物游离DNA在感染诊断中的应用

 

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参考文献


[1] Szilágyi M, Pös O, Márton É, et al. Circulating Cell-Free Nucleic Acids: Main Characteristics and Clinical Application. Int J Mol Sci. 2020;21(18):6827. Published 2020 Sep 17. doi:10.3390/ijms21186827
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[3] Snyder MW, Kircher M, Hill AJ, Daza RM, Shendure J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 2016;164(1-2):57-68. doi:10.1016/j.cell.2015.11.050
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[5] Chabon JJ, Hamilton EG, Kurtz DM, et al. Integrating genomic features for non-invasive early lung cancer detection. Nature. 2020;580(7802):245-251. doi:10.1038/s41586-020-2140-0
[6] Chen X, Gole J, Gore A, et al. Non-invasive early detection of cancer four years before conventional diagnosis using a blood test. Nat Commun. 2020;11(1):3475. Published 2020 Jul 21. doi:10.1038/s41467-020-17316-z
[7] Blauwkamp TA, Thair S, Rosen MJ, et al. Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nat Microbiol. 2019;4(4):663-674. doi:10.1038/s41564-018-0349-6

 

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