mIHC实操宝典：荧光信号出现非特异重叠，如何改善实验？

随着多重荧光免疫组化技术的不断发展，越来越多老师希望在自己的片子上看到更丰富的靶标信息，意味着我们需要用到更多种荧光染料去完成染色，但由于荧光染料产生的信号不是单纯的线性，而是呈现山峰状的分布，在最高点信号固然最好，但在最高点左右的一段范围内都能够捕获到它的信号，那么相邻的染料之间，难免会有信号的重叠，导致最后的结果无法被准确判读。

不同荧光染料光谱示意图

mIHC结果出现信号重叠，一般表现为两种情况：

1、信号重叠，没有各自独立信号存在（理论上指标间不存在共定位）

图1：左：merge；中：CD4；右：CD8

2、有各自独立的阳性信号，但大部分信号高度重叠（理论上共定位信号没有那么多）

图2：左：merge；中：CD3；右：CD8

图3：红箭头：共定位信号；白箭头：CD8信号

可能原因：选用波长十分相近的荧光染料进行了染色；前一轮染色的抗体没有洗涤干净

解决方案：

1、在选择荧光染料的时候，选择相距波长较远的荧光染料，以Absin的多色试剂盒为例，选择四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI），这几个试剂盒里的染料之间是几乎不会有串扰的情况。如染料TSA540跟TSA520、TSA570的荧光波长挨得十分接近，TSA650和TSA620挨得很近，在做染料选择的时候就要避开同时应用，比如已经用了TSA520，那在同一个项目中就不要用TSA540再进行染色；如果无法避免必须要同时用，就需要扫描仪或者显微镜具有光谱拆分的功能，完成扫描以后再在工作站进行通道的拆分优化，但至于拆分的效果也取决于染色和成像的效果，所以为了得到一个不错的结果，可能需要实验者不断地调试与优化实验的条件。

2、如果所使用的染料之间本身间隔较远，不存在光谱重叠度过高的情况，那出现这种信号的高度重叠，多半是因为前一轮抗体没有洗脱干净，且前一轮的一抗来源恰好跟后一轮相同，当前一轮没有洗干净的时候，残留的一抗也会跟后一轮的二抗结合，导致信号出现重叠。需要优化洗脱的条件。修复液+高压的条件基本都能洗脱得比较干净，但因为条件较强，很容易出现组织从片子上脱落的情况；如果是选择修复液+微波加热的方式，那就需要优化微波修复的条件，Absin实验室推荐可以采用先高火煮沸修复液，取出修复盒后快速插入待洗脱/修复的切片，盖盖子后继续放入微波炉低火维持15min，如果最后洗脱效果不理想，可以延长低火维持的时间，或者调整微波炉的功率，不同微波炉的火力和功率有区别，需要根据具体的实验结果进行更改；如果是选用Absin抗体洗脱液（abs994），则需要关注没洗干净的指标是否是一些较难洗脱的蛋白，如结构蛋白、细胞骨架蛋白、胞浆胞核蛋白，考虑需要延长洗脱的时间或更换更强的洗脱方式（如热修复），或者将难以洗干净的蛋白放到最后顺位去染色。

3、当两通道各自存在独立信号，但出现大量非特异性共定位重叠信号：

① 如图3所示，真正的共定位信号两指标荧光都很强，而非特异性的共定位信号一个指标很强，另一个指标很弱，较容易区分，在不调整实验的情况下，可以通过调整仪器的曝光时间来改善（如图中在CD8通道出现了比较弱的CD3信号，减少CD8通道的曝光时间），因为越长的曝光时间，越容易把背景和相近通道的信号曝光出来。

② 避免把会存在共表达的指标搭配波长相近染料，如CD3应用了TSA570，则CD8避开使用TSA620，可以选用相距较远的TSA700或TSA520；另外在染色的时候，根据前期预实验的结果，微调各指标的染色条件，比如单标染色发现CD3信号非常强，CD8相对CD3弱很多，在多染的时候染CD3可以再降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，以及染料孵育时间，或CD8增高抗体浓度，延长孵育时间，再搭配曝光时间的调整，也能有效避免信号串扰问题。

③ 如果仪器可以控制拍摄不同通道的顺序，相邻的通道也可以间隔开拍摄，因为荧光信号被激发以后，在信号比较强的情况下，会在片子上留存一段时间，如果紧接着拍摄邻近的通道，有可能这个邻近通道也会接收到上一个通道的残留信号，因此可以考虑间隔开拍摄。

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