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类器官RNA和蛋白提取方法

更新时间:2023-10-19      点击次数:422

很多老师咨询类器官RNA和蛋白如何提取,其实类器官可以按微小组织进行RNA和蛋白提取,今天小爱给大家讲一讲提取方法。

 

类器官蛋白提取方法

 

一、试剂准备(细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒(abs9346))

 

1、准备溶液

1)室温融解试剂盒中的各种溶液,溶解后除结构蛋白提取液外,其他试剂立即置于冰上;

2)结构蛋白提取液溶解后,可放置于37℃水浴中温浴至透明后,常温放置。

 

2、蛋白提取工作液的准备

1)胞浆蛋白提取工作液的准备:临用前,根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF;

2)胞核蛋白提取工作液的准备:临用前,根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF;

3)膜蛋白提取工作液的准备:临用前,根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF;

4)结构蛋白提取工作液的制备:临用前,根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量,并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

 

二、类器官收集及洗涤

 

1、类器官收集

移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730),轻柔吹打基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组),4℃静置10min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化),300g ,4℃, 离心5min弃上清。

 

2、类器官清洗

添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬,300g ,4℃,离心5min弃上清。

 

三、类器官蛋白提取

 

1、胞浆蛋白提取

1)向含类器官沉淀的EP中加入2mL的胞浆蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡20min;

2)准备1-5mL的注射器,用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次,在4℃条件下,15000g离心10min。取上清液存于EP管中,即为胞浆蛋白。

 

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步骤获得的沉淀物加入4mL冰浴的胞浆蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,弃去上清液,沉淀物中加入1mL冰冻的胞核蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,上清液为细胞核蛋白,转入EP管并保存。

 

3、胞膜蛋白的提取

在步骤3.2中的沉淀物中加入1mL冰冻的膜蛋白提取工作液,在4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,上清液为细胞膜蛋白,转入EP管并保存。

 

4、结构蛋白的提取

在步骤3.3的沉淀物中加入常温或37℃水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5mL,4℃条件下震荡5min,4℃条件下15000g离心10min,保存上清液即为细胞骨架蛋白。

 

5、待测蛋白的保存待检测浓度的蛋白存于-70℃,可以用于Western,EMSA,footprinting,报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

 

类器官RNA提取方法

 

一、类器官收集及洗涤

 

1、类器官收集

移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730),轻柔吹打基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组),4℃静置10min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化),300g ,4℃, 离心5min弃上清。

 

2、类器官清洗

添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬,转移到1.5mL EP管,300g ,4℃,离心5min弃上清。

 

二、类器官RNA提取(超纯总RNA快速提取试剂盒(含DNase I),货号abs60026)

 

1、向含类器官沉淀的EP中加入1mL的RL(试剂盒组分)溶解细胞,并用移液枪轻轻吹打混匀,使RL充分和类器官接触裂解细胞并灭活RNA酶;
2、将匀浆样品剧烈震荡混匀,在15-30°C条件下孵育5min以使核蛋白体分解;
3、每1mL RL加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15sec并将其在室温下孵育3min;
4、于4℃,12000 rpm离心10min,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%,把水相转移到新管中,进行下一步操作;
5、加入1倍体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内);
6、12000 rpm 离心45sec,弃废液,将吸附柱重新套回收集管;
7、加400μL去蛋白液RE,12000 rpm 离心45sec,弃废液;
8、DNase I工作液的配制:取10μL DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中,加入70μL RDD溶液,轻柔混匀;
9、向吸附柱RA中央加入80μL DNase I工作液,室温放置15min(一般情况下室温放置可得到较好的消化效果,如果室温效果不佳可选择在37℃放置15min);
10、加400μL去蛋白液RE,12000 rpm 离心45sec,弃掉废液;
11、加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000 rpm离心45sec, 弃掉废液;
12、加入500μL漂洗液RW,12000 rpm 离心45sec,弃掉废液;
13、将吸附柱RA放回空收集管中,12000 rpm离心2min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应;
14、取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量往吸附膜的中间部位加50-80μL RNase free H2O(事先在 65℃水浴中加热效果更好),室温放置2min,12000 rpm 离心1min,所得溶液即为RNA溶液。如果需要较多RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1min。

 

提取得到的RNA溶液,可以直接应用于Northern 杂交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA文库构建、体外翻译等各种常规分子生物学实验。

 

今天讲解就到这了,大家如有实验问题,欢迎公众号“AG8亚国服务生物"后台交流哦!

 

本期小爱推荐:


货号

品名

规格

abs9346

细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒

50T

abs60026

超纯总RNA快速提取试剂盒(含DNase I)

20T/50T

abs9730

类器官传代培养缓冲液

250ml/ 250ml

abs9495

基质胶(低因子、无酚红)

1.5ml*4/ 1.5ml*8

abs9444

Organotial人肝癌类器官培养基试剂盒

1kit

abs9445

Organotial人结直肠癌类器官培养基试剂盒

1kit

abs9443

Organotial人肺癌类器官培养基试剂盒

1kit

abs9449

Organotial人胃癌类器官培养基试剂盒

1kit

abs9447

Organotial人胰腺癌类器官培养基试剂盒

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abs9589

Organotial人鼻咽癌类器官培养基试剂盒

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abs9739

Organotial人脑胶质瘤类器官培养基试剂盒

1kit

abs9446

Organotial人乳腺癌类器官培养基试剂盒

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