类器官免疫荧光整体染色法

一、类器官收集及洗涤

1、类器官收集

移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组），加类器官传代缓冲液定容至10mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，冷冻3min），300g 4℃，离心5min弃上清。

2、类器官清洗

添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬，300g 4℃，离心5min弃上清。

二、类器官免疫荧光染色

1）4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，每次2min；

2）0.5%Triton透膜20min，PBS洗3次，每次2min；（如果需检测的目的蛋白属于胞内蛋白或者抗原抗体结合位点位于胞内的跨膜蛋白，抗体孵育前需进行透膜处理）

3）1%BSA室温封闭60min，PBS洗3次，每次2min；
4）5%BSA稀释的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次2min；
5）5%BSA稀释的TRITC标记的二抗，室温避光孵育1h，PBS洗3次，每次2min；
6）5ug/mLDAPI避光孵育15min，PBS洗3次，每次2min；
7）将类器官轻柔铺在载玻片上，吸水纸轻轻吸取多余残留液体；
8）指甲油封片轻柔固定，于激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察并拍摄图片。

注：PBS清洗时，可用枪头轻轻吹起避免气泡，待类器官沉淀到底部开始下一步操作。

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