神经干细胞无血清培养指南——B27

概念——Mckay于1997年在《Science》杂志上将神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的概念总结为：具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞，神经干细胞的发现打破了神经细胞不能再生的传统理论。

图1 第3、5、7代神经球巢蛋白免疫荧光染色(×400)免疫荧光染色阳性图片

特点——通过对称分裂和不对称分裂两种分裂方式完成自我更新，NSCs具有多向分化潜能，且不表达成熟抗原，不被免疫系统所识别，能通过血脑屏障，可以与宿主的神经组织良好融合，在宿主体内长期存活。

应用——神经干细胞能够趋向损伤部位，通过分泌神经营养因子或者分化为不同的细胞修复或补充受损神经组织，神经干细胞还可以作为基因载体，用于颅内肿瘤和其它神经疾病的基因治疗，此外，体外培养的神经干细胞可用于判断药效及药物毒性，例如观察某些化合物的神经活性。目前美国临床信息公示数据库中，NSCs相关的临床实验共有122例，涉及到了多发性硬化、帕金森病、胶质母细胞瘤、脊髓损伤等。

不对称分裂：一种细胞分裂的方式，母细胞产生的两个子细胞的类型各不相同。相反，对称性分裂就是产生两个相同的细胞。

神经干细胞培养——许多研究表明采用无血清培养基，NSCs 可以稳定在未分化状态，而采用含血清培养基，NSCs 多数分化为神经元和胶质细胞。

B-27添加剂（50×，不含维生素A）abs9272是无血清添加剂，包含抗氧化剂、神经细胞所需生长因子、维生素（不含维生素A）和神经元所需的脂肪酸等，以适宜比例配比，可应用于大多数神经细胞培养。无维生素 A型可防止干细胞向神经细胞分化，是神经干细胞无血清培养不能少的试剂。推荐搭配神经元基础培养基(abs9460)进行培养。 由于L-谷氨酰胺在水溶液中不稳定，神经元基础培养基和B-27中都未包含L-谷氨酰胺，因此在配制培养基时须另外添加L-谷氨酰胺。

图2 不同类型培养基(×100)形成4d神经球的比较

A:无血清培养基含有B27(2%)原代培养4d；B:含血清培养基原代培养4d

培养基配置方案

1、置于4°C解冻本产品；
2、在使用前无菌添加2％本产品和5mM L-谷氨酰胺至神经元基础培养基，配制成神经元培养基注意：剩余的本产品可以等分成工作体积，并储存在-20℃。避免反复冻融；
3、对于原代海马神经元培养，神经元培养基（由前述步骤制备）需要额外补充25μM的L-谷氨酸，在培养4天以后不再额外添加谷氨酸。配置好的培养基，可于2-8℃的避光可保存一周。

图3 B-27添加剂（50×，不含维生素A） abs9272

细胞培养步骤

1、用预冷的0.05mg/mL多聚赖氨酸水溶液包被培养皿表，每平方厘米表面使用0.15mL，室温包被1h；
2、去除多聚赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水冲洗（多聚赖氨酸对细胞有毒性）。在超净工作台中打开培养皿的盖子通风，直到干燥。培养皿干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周；
3、根据标准实验室程序或随细胞提供的说明书分离原代的大鼠神经元或解冻冻存的原代大鼠神经元；
4、在预热的（37℃）神经元培养基中（如前所述的方法制备) 接种细胞，建议的细胞密度为160个细胞/平方毫米, 或必要时使用自行优化的细胞密度；
5、在37℃，含5%二氧化碳的潮湿环境中培养；
6、培养4-24h后, 更换一半体积的新鲜培养基，继续在培养箱中培养；
7、对海马神经元以外的细胞：在接种4d后，更换一半体积的新鲜的培养基，之后每3d重复一次。 

对海马神经元：接种3d后，用不含L-谷氨酸的新鲜培养基更换一半体积的培养基。之后每3d重复一次。 

注意：在培养基中添加25µM 2-Mercaptoethanol，可改善海马神经元的长期存活率。 

其他神经细胞培养添加物

除B27（50×，不含维生素A）外，含维生素的B27(abs9120)、N-2无血清添加剂(100×)(abs9121)，以及马血清在神经细胞培养中的应用都较为广泛。

区别在于：N-2无血清添加剂是化学成分确定的添加剂，N-2 添加剂主要被推荐用于神经母细胞瘤以及周围神经系统(PNS)与中枢神经系统(CNS)来源的有丝分裂后期的神经元的生长和表达。B-27添加剂(50×)用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。其中不含维生素A款，可防止干细胞向神经细胞分化，更适合神经干细胞体外增殖。很早之前就有研究人员对比过不同种类血清对神经细胞培养的影响，结果发现相对于胎牛和其他动物血清，马血清(abs989)促进神经细胞的增殖的作用显著，与胎牛血清相比，马血清用于培养神经细胞，具有非常高的性价比。

胞胞巴适本期推荐：

[1] 吴增,李媛,靳晓飞等.神经干细胞提取与培养方法的比较研究[J].中国药理学通报,2018,34(05):729-734.

[2] 于丽华,赵书平,席先成等.不同种类血清对新生大鼠大脑皮层神经细胞培养的影响[J].实用医药杂志,2002(03):190-192.

注：文中图片来自网络或参考文献，仅供学习参考用

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