外泌体专题 | 样本处理问题

外泌体概述：

外泌体是由活细胞分泌的，包含了复杂RNA和蛋白质，直径在30-150nm的具有膜结构的小囊泡，现在特指直径40-100nm的盘状囊泡，主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等。

图 外泌体示意图

外泌体构成：

外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，并携带有DNA、mRNA、microRNA、蛋白质、脂质以及一些代谢物，目前已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。

外泌体功能：

1）介导信号转导和分子转移。作为多重信号颗粒，每个外泌体都有能力通过细胞表面同源受体的参与和聚集来传递多重组合信号，并且这种活性已被证明适用于参与生长因子、细胞因子、Wnt和Notch途径的蛋白质。此外，外泌体与靶细胞的融合具有将功能受体传递给靶细胞的能力，在某些情况下甚至激活受体和效应物；
2）人类的生殖、怀孕和胚胎发育需要精确、精细和动态的细胞间通信。母乳来源的外泌体具有调节胎儿免疫系统的功能。在母乳中，外泌体不仅促进产后胎儿健康和生长，母乳来源的外泌体含有具备免疫相关功能的miRNA，并在体外增加外周血来源的T调节细胞的数量，可能调节免疫耐受；
3）调节免疫。外泌体的供体细胞来源多种多样，如树突状细胞、抗原递呈细胞甚至免疫细胞本身，且同一种细胞细胞在不同生理环境下分泌的外泌体功能不同，可促进免疫应答，也可免疫抑制；
4）外泌体与疾病。外泌体可能在代谢性疾病的出现以及心血管健康中发挥作用，已经发现它们可以转移代谢产物，并通过小鼠和人类的胰腺b细胞、脂肪组织、骨骼肌和肝脏之间的外泌体miRNA交换促进细胞间通讯；外泌体可以参与错误折叠蛋白质的清除，从而发挥解毒和神经保护功能，进而在退行性疾病中发挥作用；与外泌体在其他疾病中的作用的研究相比，外泌体对癌症的研究进展迅速，外泌体影响肿瘤形成、肿瘤生长和转移、副肿瘤综合征和对治疗的耐药性。

图 外泌体与病毒感染

外泌体临床应用：

1）疾病诊断。外泌体存在于所有生物液体中，由所有细胞分泌，使其作为微创液体活检具有吸引力，并有可能进行纵向采样以跟踪疾病进展。外泌体诊断应用的焦点疾病包括心血管疾病、影响中枢神经系统（CNS）的疾病和癌症；
2）载体制备。与脂质体相反，外泌体具有良好的耐受性，在小鼠外源性给药时可以以最小的免疫清除率递送功能性药物；

3）治疗作用。间充质干细胞衍生的外泌体可以发挥治疗作用，并且在治疗移植物抗宿主疾病患者中的应用表明，重复注射具有良好的耐受性，不会产生显著的副作用。

外泌体研究中的样本制备：

图 外泌体研究中的样本类型

外泌体研究中的样本涉及血液、尿液、乳汁、唾液、脑脊液及细胞培养上清，整体的原则是去除细胞、新鲜样本、低温保存（-80℃）。

细胞培养上清液中外泌体提取和纯化：

所需试剂：无外泌体胎牛血清（abs993）、细胞上清外泌体提取试剂盒（abs50040）、外泌体专用无血清培养基（abs9430）/外泌体专用无血清培养基（含生长因子）（abs9774）

图 无外泌体胎牛血清 （abs993）

1）选取细胞状态良好的代次，在细胞汇合度达到60%左右时，更换为无血清培养基（abs9430）或者含无外泌体血清（abs993）的培养基，继续培养48h后，收集细胞上清液；
2）先用800~1000g左右的离心力10min有效去除细胞残留，取上清后，再3000g离心10min有效去除细胞碎片物，去除细胞碎片的离心上清液转移到新的50mL离心管中；
3）在去除杂质的离心上清液中加入Exosome Concentration Solution（ECS试剂），20mL上清液加入5mL ECS试剂；
4）加入ECS试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1min，再放置于 4℃静置至少2h；（增加静置时间可提高外泌体得率，但静置时间不可超过24h）
5）取出装有混合液的离心管于4℃以10000g离心60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液）
6）外泌体重悬：取1×PBS均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的5mL离心管中；
7）将含有重悬液的5mL离心管于4℃以12000g离心2min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒；（注：若沉淀较多，可12000g/2min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）
8）纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosome Purification Filter（EPF柱）上室中，于 4℃以3000g离心10min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：EPF柱不可重复使用）

9）外泌体的保存： 纯化后的外泌体以50-100μL进行分装保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用，外泌体保存液（2×）（abs9776），能够将外泌体在4℃条件下保存至少6个月，适用于液态及冻干形态，能够有效降低冻干对外泌体的负面影响。

注意事项：

1）在收获细胞时，尽量保证死细胞数量不超过5%，因为凋亡、死亡的细胞会分泌凋亡小体，从而对活细胞产生的外泌体造成污染；
2）如果后期要将提取的外泌体进行共孵育或者动物实验，需要用2um的滤器对外泌体进行除菌；
3）细胞上清样品越早处理越好，长时间放置，含有的细胞破裂，胞内囊泡释放也会对活细胞产生的外泌体产生污染；
4）不能用DMEM、1640、F12 这些基础培养基替代血清或者外泌体专用无血清培养基呢，细胞在这些基础培养基的环境下，是处于饥饿状态的，细胞会将培养基中的营养物质全部消耗掉的，这时的上清液中的外泌体含量会大幅度下降。

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[1] Pegtel D M, Gould S J. Exosomes[J]. Annual review of biochemistry, 2019, 88: 487-514.
[2] Kalluri R, LeBleu V S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science, 2020, 367(6478): eaau6977.

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