干货分享 | 肿瘤与巨噬细胞共培养方案

肿瘤微环境

癌症的发生与肿瘤微环境有着密切的联系，肿瘤微环境（Tumormicroenvironment，TME）是指肿瘤细胞产生和生活的内环境，且具有异质性，由肿瘤细胞及其募集的各种基质细胞如巨噬细胞、T细胞、成纤维细胞以及相关细胞因子组成，肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages，TAMs），是TME中最重要的免疫细胞之一。

图 瘤内NK细胞缺乏丰富的膜突起

免疫细胞中的“卧底"——TAMs

杀伤肿瘤？

诱导机体免疫应答？

No！No！No！

巨噬细胞可以根据其功能和活化作用分为两种亚型：经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞，M1巨噬细胞主要发挥抗肿瘤、促进免疫的作用，与经典活化亚型相反，替代活化的M2巨噬细胞在促进肿瘤生成、恶性肿瘤发生和免疫抑制中发挥作用，TAMs存在于在肿瘤的各阶段，随着肿瘤的进展，M1型逐渐向M2型极化，早期以M1型为主，中晚期以M2型为主，M2型TAMs数量的增多也提示着预后不良。

为什么研究TAMs？

图 2023年TAMs研究热点

首先TAMs对不同类型癌症的生物学行为的影响尚未清晰，探究TAMs的作用机制有助于研究者们开发以TAMs为靶点的肿瘤治疗，肿瘤治疗主要方式包括抑制肿瘤对TAMs的募集和消除肿瘤局部的TAMs，或者通过诱导TAMs表型转化和削弱其促肿瘤功能，因此，近几年有关TAMs的研究日益攀升。

TAM与癌症相互作用的研究方式——共培养

共培养是指将两种或两种以上的细胞放在同一培养系统中培养，来研究细胞间的相互作用。其优点是可以模拟体内环境，以便观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用，通过检测不同细胞因子之间的关系，探讨药物作用机制和可能的作用靶点。常用的方式包括直接接触共培养和间接接触共培养，顾名思义，直接接触式共培养将2种或2种以上细胞按照一定比例培养在同一培养皿中，适用于研究体内邻近组织细胞相互作用以及诱导细胞分化。间接接触式培养包括条件培养基共培养法、爬片式共培养法和嵌入式细胞共培养法，今天主要为大家介绍条件培养基共培养和嵌入式共培养两种方法。

1、条件培养基共培养法

所用试剂：PRMI-1640基础培养基abs9484；胎牛血清abs972；青霉素-链霉素溶液abs9244；配制成含有10%FBS和1%双抗的PRMI-1640培养基，PMA abs9107。

以THP-1和肺癌细胞共培养为例：

1）选取生长状态良好密度80-90%的THP-1细胞，消化计数后加入PRMI-1640培养基，THP-1浓度为5×10⁵个/mL；
2）加入100ng/mL PMA充分吹打混匀，铺入六孔板置于5% CO2、37℃细胞培养箱培养24h（具体浓度和作用时间可能因细胞状态等因素有所差异），24h后弃掉上清液，PBS洗涤3次，加入1640培养基恢复24h；
3）取一皿生长良好的肺癌细胞，PBS洗涤三次，加入1640基础培养基（不含血清、含1%双抗），培养24h，取上清液4℃ 3000rpm离心20min，离心后缓慢吸取上清加入10% FBS，吹打混匀，作为共培养条件培养基，4℃可保存1周，或者-80℃冰箱保存半年；

4）细胞恢复24h，去掉上清，PBS洗涤3次，取一定量的共培养条件培养基加入六孔板中（可设置梯度），补充1640培基至每孔2mL，共培养24h。

2、嵌入式共培养（Transwell小室）

Transwell小室是一类小室底具有通透性膜的杯状装置，小室和培养板底部接种不同种类的细胞，培养时将小室放入培养板从而建立细胞的共培养，Transwell小室也可用于趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验等。孔径分为0.4μm、3μm、5μm、8μm，小于3μm孔径的小室，细胞不能迁移通过，适用于共培养实验。膜材质分为PC和PET，PC膜为半透明，PET膜透明，PET更方便在显微镜下观察细胞的状态。

图 细胞小室

所用试剂：PRMI-1640基础培养基abs9484；胎牛血清abs972；青霉素-链霉素溶液abs9244；配制成含有10%FBS和1%双抗的PRMI-1640培养基，PMA abs9107；细胞小室（PET膜，24mm，孔径0.4um，含6孔板）abs7270。

1）选取生长状态良好密度80-90%的THP-1细胞，消化计数后加入PRMI-1640培养基，THP-1浓度为5×10⁵个/mL；
2）加入100ng/mL PMA充分吹打混匀，铺入六孔板置于5% CO2，37℃细胞培养箱培养24h（具体浓度和作用时间可能因细胞状态等因素有所差异），24h后弃掉上清液，PBS洗涤3次，加入PRMI-1640培养基培养至80%左右，收集M0巨噬细胞；
3）将培养小室置于6孔板上，上层加入癌细胞，下层加Ｍ0型巨噬细胞，两种细胞均匀分布于各层培养48h，细胞比例因癌细胞种类有所不同。

共培养过程中可以观察巨噬细胞的形态变化。

今天的讲解就到这里啦，感兴趣的小伙伴可以扫码加群！

本期推荐：

注：本文图片来自网络，仅供学习参考用

[2] 孟凡荣.巨噬细胞极化状态对卵巢癌转移能力的影响[D].天津医科大学,2018.

[3] Xiang W, Shi R, Kang X, et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2574.

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