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干货分享 | 肿瘤与巨噬细胞共培养方案

更新时间:2023-12-22      点击次数:497

肿瘤微环境

 

癌症的发生与肿瘤微环境有着密切的联系,肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)是指肿瘤细胞产生和生活的内环境,且具有异质性,由肿瘤细胞及其募集的各种基质细胞如巨噬细胞、T细胞、成纤维细胞以及相关细胞因子组成,肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associatedmacrophages,TAMs),是TME中最重要的免疫细胞之一。


图 瘤内NK细胞缺乏丰富的膜突起

 

免疫细胞中的“卧底"——TAMs

 

杀伤肿瘤?

诱导机体免疫应答?

No!No!No!

 

巨噬细胞可以根据其功能和活化作用分为两种亚型:经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞,M1巨噬细胞主要发挥抗肿瘤、促进免疫的作用,与经典活化亚型相反,替代活化的M2巨噬细胞在促进肿瘤生成、恶性肿瘤发生和免疫抑制中发挥作用,TAMs存在于在肿瘤的各阶段,随着肿瘤的进展,M1型逐渐向M2型极化,早期以M1型为主,中晚期以M2型为主,M2型TAMs数量的增多也提示着预后不良。

 

为什么研究TAMs?



图 2023年TAMs研究热点

 

首先TAMs对不同类型癌症的生物学行为的影响尚未清晰,探究TAMs的作用机制有助于研究者们开发以TAMs为靶点的肿瘤治疗,肿瘤治疗主要方式包括抑制肿瘤对TAMs的募集和消除肿瘤局部的TAMs,或者通过诱导TAMs表型转化和削弱其促肿瘤功能,因此,近几年有关TAMs的研究日益攀升。

 

TAM与癌症相互作用的研究方式——共培养

 

共培养是指将两种或两种以上的细胞放在同一培养系统中培养,来研究细胞间的相互作用。其优点是可以模拟体内环境,以便观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用,通过检测不同细胞因子之间的关系,探讨药物作用机制和可能的作用靶点。常用的方式包括直接接触共培养和间接接触共培养,顾名思义,直接接触式共培养将2种或2种以上细胞按照一定比例培养在同一培养皿中,适用于研究体内邻近组织细胞相互作用以及诱导细胞分化。间接接触式培养包括条件培养基共培养法、爬片式共培养法和嵌入式细胞共培养法,今天主要为大家介绍条件培养基共培养和嵌入式共培养两种方法。

 

1、条件培养基共培养法

 

所用试剂:PRMI-1640基础培养基abs9484;胎牛血清abs972;青霉素-链霉素溶液abs9244;配制成含有10%FBS和1%双抗的PRMI-1640培养基,PMA abs9107。

 

以THP-1和肺癌细胞共培养为例:

1)选取生长状态良好密度80-90%的THP-1细胞,消化计数后加入PRMI-1640培养基,THP-1浓度为5×105个/mL;
2)加入100ng/mL PMA充分吹打混匀,铺入六孔板置于5% CO2、37℃细胞培养箱培养24h(具体浓度和作用时间可能因细胞状态等因素有所差异),24h后弃掉上清液,PBS洗涤3次,加入1640培养基恢复24h;
3)取一皿生长良好的肺癌细胞,PBS洗涤三次,加入1640基础培养基(不含血清、含1%双抗),培养24h,取上清液4℃ 3000rpm离心20min,离心后缓慢吸取上清加入10% FBS,吹打混匀,作为共培养条件培养基,4℃可保存1周,或者-80℃冰箱保存半年;

4)细胞恢复24h,去掉上清,PBS洗涤3次,取一定量的共培养条件培养基加入六孔板中(可设置梯度),补充1640培基至每孔2mL,共培养24h。

 

2、嵌入式共培养(Transwell小室)

 

Transwell小室是一类小室底具有通透性膜的杯状装置,小室和培养板底部接种不同种类的细胞,培养时将小室放入培养板从而建立细胞的共培养,Transwell小室也可用于趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验等。孔径分为0.4μm、3μm、5μm、8μm,小于3μm孔径的小室,细胞不能迁移通过,适用于共培养实验。膜材质分为PC和PET,PC膜为半透明,PET膜透明,PET更方便在显微镜下观察细胞的状态。


图 细胞小室

 

所用试剂:PRMI-1640基础培养基abs9484;胎牛血清abs972;青霉素-链霉素溶液abs9244;配制成含有10%FBS和1%双抗的PRMI-1640培养基,PMA abs9107;细胞小室(PET膜,24mm,孔径0.4um,含6孔板)abs7270。

 

1)选取生长状态良好密度80-90%的THP-1细胞,消化计数后加入PRMI-1640培养基,THP-1浓度为5×105个/mL;
2)加入100ng/mL PMA充分吹打混匀,铺入六孔板置于5% CO2,37℃细胞培养箱培养24h(具体浓度和作用时间可能因细胞状态等因素有所差异),24h后弃掉上清液,PBS洗涤3次,加入PRMI-1640培养基培养至80%左右,收集M0巨噬细胞;
3)将培养小室置于6孔板上,上层加入癌细胞,下层加M0型巨噬细胞,两种细胞均匀分布于各层培养48h,细胞比例因癌细胞种类有所不同。

 

共培养过程中可以观察巨噬细胞的形态变化。

 

今天的讲解就到这里啦,感兴趣的小伙伴可以扫码加群!

 

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货号

产品名称

规格

abs972

胎牛血清(优级)

500mL

abs974

胎牛血清(标准级)

500mL

abs9484

RPMI 1640培养基(含L-谷氨酰胺,不含HEPES)

500mL

abs9107

佛波酯

1mg

abs7270

细胞小室(PET膜,24mm,孔径0.4um,含6孔板)

1箱

abs7274

细胞小室(PET膜,12mm,孔径0.4um,含12孔板)

1箱




注:本文图片来自网络,仅供学习参考用

 

参考文献


[2] 孟凡荣.巨噬细胞极化状态对卵巢癌转移能力的影响[D].天津医科大学,2018.

[3] Xiang W, Shi R, Kang X, et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2574.



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