国自然研究热点“常青树”—外泌体介绍II

背景介绍：

自从2013年荣获诺贝尔奖后，外泌体就一直是国际科研界的研究热点。近十年来，它的热度一直居高不下，如今依然稳坐在国自然热点排行榜的第五名！让我们继续揭开这个细胞外囊泡的神秘面纱！

外泌体个人名片：

姓   名：外泌体 (Exosome) ；

种   属：细胞外囊泡；

大   小：直径30-150nm；

密   度：1.1-1.18g/mL；

形   状：呈“茶托状"；

来   源：由所有活细胞分泌；

存   在：几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中；

数   量：人体中大约有10¹⁴个，近乎于平均每个细胞产生1000-10000个；

功   能：调节细胞代谢、控制炎症、促进血管新生、促进组织修复、免疫调节、癌症的发生发展、抗原呈递等；

荣   誉：获得2013年诺贝尔生理学或医学奖。

携带物质：脂质、蛋白质、DNA和RNA (miRNA、lncRNA、circular RNA、mRNA) ；

突出特性：异质性，即同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大的功能区别；

图 外泌体结构与特征

外泌体的特性及相关应用：

1、异质性，可作为生物标记物，用于疾病诊断

不同细胞分泌的外泌体在数量、细胞膜与内容物成分、生物学功能都有所不同，具有异质性；外泌体的大小和含量可反映分泌细胞的类型和状态，并能精准调控机体内的各种生理活动，可作为生物标志物用于疾病诊断。通过分离、提纯体液中的外泌体，分析其内含的特征miRNA或蛋白质等，再通过与疾病特征标志物进行比对就能判断疾病类型。

2、呈递性，可用于免疫调控

外泌体一般通过传递多种生物分子完成抗原呈递、免疫活化抑制及免疫耐受过程。其中，抗原呈递细胞分泌的外泌体能携带并呈递相关复合物，通过减弱或增强免疫反应达到免疫治疗的目的。此外，外泌体还装载着诸多免疫相关分子，包括溶酶体相关膜蛋白1和2、免疫球蛋白超家族成员8及MHC ，可特异性结合相关肽链、诱导免疫应答。

3、脱免性，可作为药物递送载体

外泌体具有免疫原性低特点，可逃逸大部分免疫系统的识别和攻击。相较于传统化学药物的生物相容性差、易被人体清除、溶解度及渗透性差等缺点，外泌体具有诸多优势如：纳米尺度的体积、低细胞毒性、良好的生物膜透膜性和生物相容性，且其脂质双层膜结构可保护内容物不被降解，维持生物活性。因此，外泌体可作为载体递送药物，帮助药物逃逸免疫系统、跨越组织屏障，提高药物递送和吸收效率。

4、促瘤性，可应用于肿瘤治疗

肿瘤细胞来源外泌体的促瘤性表现为在调节机体免疫功能的同时，也会向受体细胞传递有害信息，导致细胞病变；并且，肿瘤细胞还会通过分泌外泌体将一部分药物排出细胞或与功能性药物抗体结合，降低药效、产生耐药性。诸多研究表明，晚期肿瘤细胞分泌的外泌体可抑制抗肿瘤的免疫应答，促进肿瘤的生长与扩散。近年来，外泌体在肿瘤治疗应用方面产生了诸多新的干预措施，如阻止外泌体的生成、分泌和阻断外泌体介导的细胞通信。

5、诱导性，可应用于再生医学

外泌体还具有诱导细胞分裂和分化的功能，可促进间充质干细胞 (MSCs) 分化为不同细胞以替代受损的组织细胞，应用于再生医学领域。如从人脐带间充质干细胞的条件培养液中提取的外泌体可促进细胞的增殖及迁移，抑制线粒体凋亡信号通路，从而促进皮肤创面的修复。许多公司已研发出基于外泌体的再生医学产品，涵盖伤口再生、药妆产品、美容等领域。

外泌体研究整体方案：

图 外泌体整体研究方案流程图

外泌体鉴定：

在上一期——《国自然研究热点“常青树"—外泌体介绍Ⅰ》文章中，给大家详细介绍了外泌体提取纯化的各类方法。外泌体分离纯化之后，需要进行表征鉴定，以判断纯化效果，并评估获得的外泌体是否满足下游实验的需求。对外泌体进行表征鉴定的方法很多，分析的指标也是多方面的，其中大小、形态、表面标志物这三个方面的检测是最重要的，这也是国际细胞外囊泡学会 (ISEV) 建议对分离获得的外泌体必须进行的表征鉴定方法。

1、外泌大小/形态鉴定—电子显微镜

扫描电镜 (SEM) 或透射电镜 (TEM) 等电子显微镜可以直观的看到粒子的形态，因此可以用于鉴定外泌体的存在和完整性。操作步骤大致是：用PBS重悬提取的外泌体，滴于孔径2nm的载样铜网上，室温静置2min，用滤纸从滤网侧边吸干液体，用3%磷钨酸溶液在室温下负染5min，滤纸吸干负染液，室温晾干，电镜观察拍照。外泌体在电镜下具有非常明显的膜边界、呈30~150nm大小不一的茶托或杯状结构（也会有200nm以下、较难鉴别的其他形状的外泌体）。

图 电子显微镜检测外泌体形态

注：图片来源于网络，如有侵权请联系删除。

2、外泌体粒径/浓度检测—纳米颗粒示踪分析 (NTA)

NTA技术可检测外泌体的粒径和数量，其操作步骤是：将收集的外泌体用PBS稀释至10⁶ 个/mL，用1mL注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪；激光光束穿过样本室外泌体颗粒，通过装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化，捕捉外泌体的布朗运动，最后利用方程式根据其运动计算浓度和流体力学直径。相较于其他外泌体鉴定方式，NTA技术的样本处理更简单，更能保证外泌体原始状态，检测速度更快。

图 NTA检测外泌体粒径/浓度

3、外泌体表面标志物鉴定—WB检测

对外泌体生化方面的分析鉴定主要是对其所携带的特异性蛋白标记物的检测，WB检测是一种常见的外泌体特定蛋白（如四跨膜蛋白、肿瘤易感基因101蛋白﹑脂筏标记蛋白、凋亡诱导因子6相互作用蛋白等）分析技术。具体操作参考标准WB操作，利用外泌体特异性蛋白的抗体进行标记，从而对外泌体进行定性检测分析。

图 WB检测外泌体标志性蛋白

还有其他方法可以用于鉴定外泌体，如ELISA、流式细胞术及质谱也常用于检测外泌体的数量及表面标志蛋白如CD9、CD63、CD81的表达。

外泌体定量检测试剂盒介绍：

AG8亚国服务ELISA夹心法检测外泌体含量试剂盒(abs50054)，利用高性能抗CD9捕获和抗CD81检测抗体，可用于检测人体体液或细胞培养上清液，灵敏和定量地检测共表达外泌体表面标记CD9和CD81的靶标，实现样本中完整外泌体的快速精准定量。

图 外泌体定量检测试剂盒原理

产品组分：

实验步骤：

1、试剂配制

1）所有试剂应在使用前室温平衡至少15min；

2）取浓缩洗液，用蒸馏水或去离子水将20X浓缩洗液稀释成1X工作液，混匀备用；

3）显色底物液在检测前A和B按1:1混匀使用。

2、实验过程

1）准备板条，试剂充分摇匀；

2）用移液枪分别取100μL标准品SO-S5，待测样品分别加入微孔板；

3）用封板膜封好板孔，37℃，60min；

4）工作液洗液清洗3次，每次300-350μL/孔，在吸水纸上拍干板孔中残留液体；

5）每孔加入100μL酶结合物；

6）用封板膜封好板孔，37℃，60min；

7）工作液洗3次，每孔300-350μL/孔，在吸水纸拍干；

8）向反应孔加入100μL显色底物液工作液，37℃避光反应30min，加入50μL终止液，酶标仪450nm下读数，并绘制XY线性曲线。

3、校准程序

XY线性拟合，其线性相关系数R²≥0.99，每次实验都要做全套校准品，绘制曲线。

参考文献：

[1] 史玉潇,芦晓红,卢望丁等.外泌体的生物学性质及应用概述[J].中国医药工业杂志,2023,54(07):1008-1019.DOI:10.16522/j. c nki.cjph.2023.07.004.

[2] Wu Y, Deng W, Klinke DJ 2nd. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 2015 Oct 7;140(19):6631-42. doi: 10.1039/c5an00688k. PMID: 26332016; PMCID: PMC4986832.

[3] Wang Y, Zhang L, Li Y, Chen L, Wang X, Guo W, Zhang X, Qin G, He SH, Zimmerman A, Liu Y, Kim IM, Weintraub NL, Tang Y. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. Int J Cardiol. 2015 Aug 1;192:61-9. doi: 10.1016/j.ijcard.2015.05.020. Epub 2015 May 8. PMID: 26000464; PMCID: PMC4469495.

[4] 南德. 脂肪干细胞外泌体的分离鉴定及递送姜黄素的体外抗肝癌研究[D].大连理工大学,2021.DOI:10.26991/d. c nki.gdllu.2020.001248.
 

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