国自然研究热点“常青树”—外泌体&miRNAⅢ

背景：

外泌体是细胞分泌的一类具有细胞间通讯作用的细胞外囊泡，已被证明外泌体中包含了大量的脂质、蛋白质、酶、核酸等生物活性物质。其中的微小RNA (microRNA，miRNA) 是外泌体中比较具代表性的，也是目前研究最多的核酸。miRNA是18-25个核苷酸的非编码小RNA分子，它可以通过与靶mRNA的3’非翻译区或开放阅读框区域结合而介导转录后基因沉默，在细胞增殖、分化、迁移及疾病发生和发展等过程中发挥重要调控作用。

miRNA的生成：

miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成长度约为几千个碱基的初级miRNA (pri-miRNA) 。pri-miRNA在蛋白复合物Drosha-DGCR8的作用下被加工成具有茎环结构的前体miRNA (pre-miRNA) ，pre-miRNA在转运蛋白的协助下从核内转运到细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA被Dicer-TRBP识别，并通过对茎环结构的剪切和修饰，形成双链成熟的miRNA，但其中一条链迅速降解，另一条链被转载进AGO2蛋白中，形成RISC（RNA诱导沉默复合体），最终生成成熟的、具有功能单链miRNA。

单链miRNA与靶miRNA转录物相互作用，从而导致基因表达的抑制。

图 外泌体miRNA分泌机制

miRNA的特性：

1、高度保守性：miRNA保守性具有重要的生物学意义，提示在不同生物发育过程中，miRNAs具有相同的调控机制；

2、组织表达特异性：一些miRNA表达具有细胞和组织特异性；

3、时序表达特异性性：在不同组织、不同发育阶段，miRNA的表达水平有显著差异，miRNA表达是动态调控的。

miRNA的功能：

目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。但这些miRNAs调节了细胞生长，组织分化，因而与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明：miRNAs在细胞生长和凋亡，血细胞分化，神经元的极性，胰岛素分泌，大脑形态形成，心脏发生，胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。对于新的miRNA基因的分析，可能发现新的参与器官形成、胚胎发育和生长的调节因子，促进对癌症等人类疾病发病机制的理解。

miRNA检测方法：

考虑到miRNAs在基因调控和生物学功能中起到的关键作用，对miRNAs的特异性和敏感性检测变得越来越重要。传统的针对miRNA的检测有Northern blotting、微阵列分析和定量聚合酶链反应 (qPCR) 。

1、Northern blotting

Northern blotting是检测miRNA的标准和比较广泛使用的方法。它不仅可以用于成熟miRNA的检测，还可以用于其前体的检测。其基本原理是将RNA样品用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，根据其在凝胶中的位置变性并转移到硝化纤维素膜或尼龙膜上，固定后与同位素或其他标记探针反应。洗净游离探针后，可以通过放射自显影或其他合适的技术检测miRNA。Northern blotting可以检测到miRNA的相对分子大小和相对丰度，但也存在半定量、低通量、繁琐、耗时、RNA易降解等缺点。

2、微阵列分析

微阵列分析是快速、高通量检测miRNA比较广泛使用的方法。该方法原理是使用标记探针通过反转录产生样品RNA，使用与目标miRNA具有相同序列的固相寡核苷酸检测这些荧光团或生物素标记的cDNA。将标记的cDNA样品装入每个孔中，然后进行一系列洗涤步骤以去除游离DNA。如果杂交的cDNA被生物素化，链霉亲和素标记的荧光团就可以被标记;如果用荧光团标记cDNA，则可以直接测量每个孔的荧光强度。每个孔的荧光强度可以用来确定miRNA的表达水平。虽然微列阵芯片针对的样本数量很多，但是成本也非常高。另外太短、低拷贝数的miRNA无法被检测到。

3、qPCR

qPCR因其动态范围大、灵敏度高、序列特异性高，已成为检测miRNA表达的常规可靠技术。首先通过逆转录反应将目标miRNA合成为cDNA，然后进行qPCR检测。要进行miRNA逆转录，需要对miRNA分子进行加长改造，一种方法采取的是进行Poly (A) 加尾，另一种采取的茎环法进行加长。监测miRNA的qPCR方法有两种：TaqMan探针法和SYBR Green荧光染料法。

miRNA定量全套实验步骤：

图 miRNA qPCR解决方案

从各类样本中提取miRNA，根据miRNA数量选择不同逆转录方法合成cDNA（如何选择miRNA逆转录方法见），最后进行miRNA定量。我们推荐从miRNA提取到逆转录、定量需要要配套的试剂盒。

一、miRNA提取

* 以血清血浆样本为例进行介绍（血浆血清miRNA提取试剂盒，abs60264）

1、实验前处理；

1.1 实验前自行准备：无水乙醇、1.5mL RNase-free灭菌离心管。
1.2 取出洗涤液，按以下操作：
a）洗涤液A：按终浓度30%的比例加入无水乙醇，如7mL加入3mL无水乙醇；14mL加入6mL无水乙醇，充分混匀。
b）洗涤液B：按终浓度85%的比例加入无水乙醇，如1.5mL加入8.5mL无水乙醇；3mL加入17mL无水乙醇，充分混匀。
* 配制好的洗涤液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用。

2、取无RNA酶的1.5mL离心管，加入200μL样本，200μL miRNA释放剂及20μL消化液，充分混匀，65℃水浴10min；
3、加入5μL miRNA富集剂，0.85mL无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取与后续实验；
4、将吸附柱放入收集管内，将650μL上述溶液转入吸附柱内，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；将剩余溶液转移至吸附柱内，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
5、将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液A至吸附柱内，静置2min，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6、将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液B至吸附柱内，静置2min，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
7、将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液B至吸附柱内，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
8、按每份样本30μL取洗脱液（如10份提取样本，即取300μL洗脱液），放置于灭菌1.5mL离心管，65℃预热；
9、将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心2min，离去残留的洗涤液；
10、取出吸附柱，放入新的1.5mL RNase-free灭菌离心管内，开盖，室温放置2min；
11、在吸附柱中心加入30μL预热洗脱液，静置2min，12000rpm离心1min，收集miRNA溶液。提取的miRNA即可用于下一步实验或-70℃保存。

二、miRNA逆转录

* 以加尾法为例进行实验步骤介绍，血浆miRNA加尾法逆转录试剂盒（abs60266）

1、RNA加A尾

 取RNase-free离心管，配制如下混合液：RNase free ddH₂O to 20μL 、Poly A 1μL、2xPoly A Buffer 10μL、RNA 5~9μL轻轻混匀，37℃ 30min，迅速置于冰上。

2、RT反应液配制：

上述反应液在使用前5000rpm离心5s：取上述反应液8μL、2x RT Buffer 10μL、 RTase Mix 2μL用移液器轻轻吹打混匀。

3、RT反应：

25℃ 5min、50℃ 15min、85℃ 5min反应完毕后，5000rpm离心5s，尽快放于冰上，直接进行PCR反应。如暂时不用，请放置于-20°C以下温度，在半年内使用完毕，不要反复冻融。模板如具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55℃。

三、miRNA qPCR

* 逆转录选择加尾法，qPCR反应选择配套的加尾法qPCR试剂盒，miRNA加尾染料法荧光定量PCR试剂盒（abs60271）

1、配制反应体系

取RNase-free离心管，配制如下混合液：

* a）Specific Primer指miRNA的上游特异性引物，即由本公司设计的正向引物，一般标注为：xx-miR-X-X-F，该引物可自行设计合成，本公司也可免费提供设计；若使用U6作为参照时，Specific Primer标注为U6-Forward Primer。

* b）Tag Primer为本公司专用miRNA反向引物，若使用U6作为参照时，Tag Primer标注为 U6-Reverse Primer。

2、设置反应程序

* 仪器类型不同，熔解曲线采集程序不同，使用仪器默认熔解曲线采集程序即可。

3、检测及结果分析

在适当的qPCR仪器上完成实验，并分析结果。

FAQ：

1、miRNA逆转录&qPCR方法有哪些？

加尾法（常用，一次可以检测多种miRNA，非常加方便）；

茎环法（常用，一次只能检测一种miRNA，但是特异性高）；

探针法（较上面二种方法用的会相对少一些，特异性、灵敏度最高）。

2、miRNA逆转录加尾法与茎环法的具体区别？

1）加尾法：

对所有的miRNA都进行polyA加尾，选用通用的逆转录引物，把所有的miRNA都进行逆转录，逆转录的产物可以分别用于各个miRNA的qPCR的反应。一般如果检测的miRNA数量比较多的话，比较推荐加尾法做，因为一次性可以逆转录很多miRNA。（例如要检测5种miRNA，就选加尾法，买一套试剂盒就能同时测5种）

2）茎环法：

对每个miRNA进行单独逆转录，每个miRNA都要有特异的逆转录引物，同时qPCR引物也是特异的，所以它的特异性比加尾法高，但是一次只能测一种miRNA。当miRNA数量不多，选茎环会比较好。（例如要检测1-2种miRNA，并且追求特异性，就选茎环法。）

3、miRNA逆转录和miRNA q-PCR一定要配套使用吗？

是的，因为逆转录试剂盒和q-PCR试剂盒里面有成分相互关联，不能分开使用，所以买逆转录就一定要买对应qPCR试剂，并且我们还免费设计引物。

miRNA茎环法逆转录配miRNA茎环法qPCR；

miRNA加尾法逆转录配miRNA加尾法qPCR；

miRNA探针法逆转录配miRNA探针法qPCR。

4、哪种miRNA逆转录&qpCR选择哪种方法价格便宜呢？

选择加尾法还是茎环法，具体是看具体实验需求，不能以价格来选择；

加尾法：一套试剂盒价格虽然贵些，但它一次能测多种miRNA，所以样本量多的情况下价格又便宜了；

茎环法：一套价格便宜，但是一次只能测一种，如果再测第二种第三种，又要重新设计引物，买试剂盒，总价格就高了。

5、miRNA引物怎么送？

免费设计1个miRNA引物，比如需要5个miRNA的引物，那么可以送其中一种，其余4种不送，需要定制合成购买，需要按照要求发送引物的目的基因。

6、关于miRNA引物合成，需要给什么信息？

需要发送引物的目的基因，也就是miRNA名字、ID号、序列，其中miRNA的名字和序列最重要，目的基因需要客户自己去查询确定；

一般引物信息格式如下：hsa-miR-22-3p AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU。

7、引物哪些在试剂盒里，哪些不在试剂盒中？U6分别是几条？

加尾法一套:

miRNA加尾法逆转录（逆转录引物，通用的，在试剂盒里面）；

miRNA加尾法qPCR（送上游引物，是特异性引物，要单独设计，不在试剂盒里面；下游引物，是通用引物，在试剂盒里面）；

U6内参：2条（不送，不在试剂盒里面，需要客户自己准备）；

定量U6-F（指U6上游）；定量U6-R（指U6下游）。

茎环法一套:

miRNA茎环法逆转录（送茎环引物，是特异性引物，要单独设计，不在试剂盒里面）；

miRNA茎环法qPCR（送上游引物送，是特异性引物，要单独设计，不在试剂盒里面；送下游引物，是通用引物，在试剂盒里面）；

U6内参：3条（不送，不在试剂盒里面，要客户自己准备。因为茎环法是特异的，所以它的U6也是要单独设计一套）；

U6-NZL（指U6的逆转录）；U6-F（指U6的上游）；U6-R（指U6的下游）。

探针法一套:

探针法逆转录（逆转录引物混在Taqman buffer里）;

探针法qPCR（上游+下游+探针，混在primer mix里，不是独立的管子）;

U6内参（不送，U6上游+U6下游+探针，混合在一个管子，需要客户自行购买）。

8、U6内参是什么？

内参是在各类细胞中普遍存在的一个基因，用于排除由于加样量差异导致的误差。做miRNA逆转录和qPCR实验过程中是需要内参的，客户一般会选择合适的基因作为内参，不一定非要选择U6。但一般都是以U6内参为主，它是比较常用的。

9、可以发送试剂盒引物序列吗？

miRNA引物的序列公司这边是保密的。如果客户需要发表文章必须要用到的情况下可以提供，但是前提是需要客户在文献里写明：设计与合成来自AG8亚国服务（上海）生物科技有限公司，并附上产品货号。

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[1] Yu X, Odenthal M, Fries JW. Exosomes as miRNA Carriers: Formation-Function-Future. Int J Mol Sci. 2016 Dec 2;17(12):2028. doi: 10.3390/ijms17122028. PMID: 27918449; PMCID: PMC5187828.

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