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秘诀在手│多肽的恒久保存与轻松溶解术

更新时间:2024-01-18      点击次数:495

肽 (Peptide) 是α-氨基酸脱水缩合,以肽键 (-CO-NH-) 连接在一起形成的化合物,是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸脱水缩合形成的化合物叫做二肽,以此类推三肽、四肽、五肽等。有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽或小分子肽;10~50个氨基酸组成的肽称为多肽。根据组成多肽的氨基酸种类和数量,多肽具有多种生理功能。在医学领域,多肽可用于模拟细胞、诊断疾病和疾病治疗等方面。此外,多肽还具有抗氧化的护肤作用。因此,多肽在生物、医学和化妆品等领域具有重要的应用价值。


 

一、多肽的保存

 

多肽的保存分两种情况:一种是冻干多肽的保存,一种是多肽溶液的保存。

 

冻干多肽的保存:市售多肽大多数是以冻干粉的形式提供,必须冷冻干燥保存。其在-20℃比较稳定,特别是冷冻干燥后保存于-80℃干燥器中,可以维持几年的活性。


在使用前,应先将装有多肽的原瓶置于干燥条件下(如装有干燥剂的干燥箱)恢复至室温,否则多肽可能会因为吸潮导致稳定性降低。瓶盖打开后,应快速称量(微量级多肽可以原瓶溶解,无需称量),并立刻密封避免潮解。

 

多肽溶液的保存溶解后的多肽稳定性相对于冻干粉状态会差很多,一般建议溶解的多肽储存液按每次的实验用量分装后-20℃保存。避免反复冻融,因为多次冻融会降低多肽的活性。使用时,取储存液稀释成工作液,现配现用,当天实验未用完的少许多肽溶液建议丢弃。

 

细菌能够降解多肽,因此多肽需要溶解在无菌的溶剂中(或者用0.2/0.45μm孔径的滤膜过滤除菌)。 此外,需要注意的是含有天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Typ)的多肽易被氧化, 需要保存在无氧化剂的环境中。

 

二、多肽的溶解

 

多肽相对一般的生化试剂来说价格比较昂贵,而且溶液状态不稳定,因此科研人员在使用时需要谨慎。多肽的溶解是非常重要的步骤,溶剂选择不当会导致多肽不溶或部分溶解,甚至实验无法进行下去。选择溶解多肽的溶剂时,通常先用无菌水进行溶解度测试(尤其是只有几个氨基酸组成的寡肽)。对于其他特殊多肽,应关注组成多肽的氨基酸性质(表1),然后确定要溶解的多肽是酸性、中性还是碱性多肽。

 

表1 常见氨基酸的酸碱性


酸碱性

氨基酸

特点

酸性氨基酸

谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)

分子中含有一个氨基和两个羧基

中性氨基酸

甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸 (Val)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸 (Ser)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)

分子中只含有一个氨基和一个羧基

碱性氨基酸

赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)

分子中含两个氨基和一个羧基




 

多肽酸碱性判断技巧

 

将多肽序列中的每个酸性氨基酸和C端的羧基-COOH赋值为+1、每个碱性氨基酸和N端的氨基-NH2赋值为-1、中性氨基酸赋值为0,以此为基础计算整条多肽的值,最终得分为正的称为酸性多肽,得分为负的称为碱性多肽,得分为零的称为中性多肽。

 

酸性多肽的溶解:先尝试用水溶解,如果用水不能溶解,尝试使用13%的氨水(v/v)来溶解,并将多肽溶液稀释至需要的浓度。如果多肽序列中包含半胱氨酸(Cys),不能使用碱性溶液进行溶解(在碱性溶液中,半胱氨酸分子会接受质子,形成带正电荷的离子,溶解度会降低。)可以使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)进行溶解。

 

中性多肽的溶解:通常先用最少量的强有机溶剂溶解。先尝试使用甲醇、异丙醇或乙腈进行溶解。对于疏水性很强的多肽,先用少量的DMSO(序列中无Cys、Met、Trp )溶解,再稀释到需要的浓度。将溶解肽的有机溶剂缓慢地逐滴加入水溶液中,如果溶液变浑浊,可能是达到了溶解极限,不能再继续溶解。


碱性多肽的溶解:先尝试用水溶解,如果不能溶解,尝试使用10%-30%的醋酸来溶解。如果多肽还是不溶,建议尝试TFA(<50μL)或纯醋酸来溶解,最后将多肽溶液稀释到需要的浓度。

 

易聚集肽的溶解:对于Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Ser、Thr、Tyr含量高(>75%)的多肽易聚集(水溶液中易形成多余的分子间氢键),可以用6M的盐酸胍 (Guanidine hydrochloride) 或8M的尿素 (Urea) 溶解制备储存液,最后稀释到需要的浓度。

 

三、多肽应用

 

客户案例:NOX2抑制剂gp91 ds-tat (abs45153114)用于进一步验证人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 在高糖环境中ROS产生的来源。

 

产品简介gp91 ds-tat是一种有生物活性的肽(NADPH氧化酶组装肽抑制剂),科学研究中常用作NOX2信号通路抑制剂。 分子式:C109H202N52O25S1;分子量:2673.19;纯度:95%。

序列:H-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Ser-Thr-Arg-Ile-Arg-Arg-Gln-Leu-NH2

 

实验方法:

1、人脐静脉内皮细胞接种于6孔板上(5 ×104个/孔)。

2、用PBS、芦丁、GKT137831(NOX4抑制剂)和Nox2ds-Tat(即gp91 ds-tat)预处理0.5h,然后用高糖处理48h。

3、收集细胞,用10mM DCFH-DA在37℃黑暗条件下孵育30min后用冷PBS洗涤细胞两次。

4、用流式细胞仪 (Becton,Dickinson and Company,New Jersey,USA) 在激发波长为488nm,发射波长为525nm的条件下分析细胞。用Cell Quest软件 (Moleular Devices Corporation) 计算ROS的相对荧光强度。

 

实验结果图:




 

* 数据来源:Wang W, Wu QH, Sui Y, et al. Rutin protects endothelial dysfunction by disturbing Nox4 and ROS-sensitive NLRP3 inflammasome[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie, 2017.

 

本期小爱为大家介绍了多肽的保存、溶解和文献应用。多肽是一类非常不稳定的化合物,所以我们在使用时最好现配现用。如果您的多肽没有溶解方法可供参考,建议先用少量肽来测试最适溶解方法,只有当多肽溶解后,才能加入溶液并将之稀释至最终浓度。AG8亚国服务(上海)生物科技有限公司提供多品类生物活性肽,广泛应用于疾病研究、药物和疫苗开发等领域。除此之外,我司还可提供定制服务,包括小分子化合物/多肽/蛋白/抗体的定制及标记服务,体系成熟。

 

附表:氨基酸简写符号

 

免责声明:有些多肽在使用前需要做溶解度测试,本文仅供您参考,希望对您溶解多肽有所帮助。

 

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货号

产品名称

产品描述

abs45153114

gp91 ds-tat

NADPH氧化酶组装肽抑制剂;NOX2抑制剂。

abs45128173

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β-淀粉样多肽(1-42),可用于构建阿尔兹海默症模型。

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β-Endorphin

β-内啡肽,垂体和下丘脑中重要的内源性肽,可缓解疼痛。

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艾塞那肽,GLP-1受体激动剂

abs45152615

LL-37

LL-37 amide具有抗癌活性,可用于癌症研究。

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4N1K

一种细胞结合结构域粘附肽,已被鉴定为IAP激动剂。

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司美格鲁肽,GLP-1受体激动剂。

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Gastrin I (human)

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abs815889

MOG(35-55)

常与百日咳毒素(PTX)配合使用,诱导实验性EAE模型。




 

 

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