分子生物学实验“酶”你不行！

做了这么多年的分子实验，对于其中的工具酶大家都了解吗？他们的作用原理都知道吗？本期Absin分子小课堂小爱要教大家如何分清这些复杂的酶。

工具酶是一类在DNA重组过程中，用于不同DNA分子的制备、切割、修饰、扩增、核酸分子的标记以及核苷酸序列测定的酶的统称，是基因重组技术所需的工具。根据催化反应特性可分为限制性内切酶、聚合酶、连接酶、逆转录酶等多种类型。

限制性内切酶

限制性内切酶主要从原核生物中发现，以内切方式水解核酸中磷酸二酯键，对外源性的DNA进行切割、水解，被称为“基因剪刀"。限制酶来源于细菌的“限制—修饰"系统，最早发现于20世纪60年代末。根据限制酶的结构与作用方式，可将其分为Ⅰ类限制酶(TypeⅠ)、Ⅱ类限制酶(TypeⅡ)和Ⅲ类限制酶(TypeⅢ)3种类型。其中，Ⅱ类限制酶识别切割位点比较专一，且不具有甲基化酶的活性，在DNA重组中被广泛应用。

AG8亚国服务拥有不同的TypeⅡ型限制性内切酶产品：

产品优势：

1、快速：5-15min内即可完成酶切；

2、便捷：共用一种酶切Buffer，简化酶切体系；

3、兼容性高：在不同缓冲液中均具有很高活性；

4、良好酶活冗余度，轻松应对底物过量或困难模板酶切。

DNA连接酶

DNA连接酶主要用于基因工程中，将由限制性核酸内切酶“剪"出的粘性末端重新组，故也称“基因针线"。作用原理为DNA连接酶催化双链DNA链一条链上切口的连接，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-Po4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。T4 DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，可催化双链DNA的粘性末端、平末端及RNA-DNA杂合体中单链的连接，在分子生物学中有广泛的应用。

DNA聚合酶(DNA polymerase)

DNA聚合酶以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。实验室常用的DNA聚合酶有普通耐热型Taq DNA聚合酶、高保真型DNA聚合酶。

逆转录酶

逆转录酶（反转录酶）又称为依赖RNA的DNA聚合酶。该酶以RNA为模板，以dNTP为底物，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA, CDNA)。

核酸酶

核酸酶主要有三类，分别是：

1、脱氧核糖核酸酶(DNase)：DNase只能水解DNA的磷酸二酯键。胰DNasel可切割双链和单链DNA，产物为5’-磷酸寡核首酸，牛脾DNasell降解DNA则产生3’-磷酸为未端的寡核苷酸；

2、核糖核酸酶(RNase)：将RNA降解为小片段的核酸酶；

3、非特异性核酸酶：将DNA、RNA都可进行水解。

其他酶

FAQ：

1、限制性内切酶无法切割DNA有哪些原因？

a. 内切酶失活：用标准底物检测酶活性；

b. DNA不纯，含有SDS、酚、EDTA等内切酶抑制因子：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA；

c. 条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳；

d. DNA不存在该酶识别序列：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化验证。

2、酶切后的DNA片段连接效率低？

a. 含磷酸盐的浓度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸盐；

b. 内切酶失活或含有ATP酶：更换内切酶；

c. 平末端连接：加大T4 DNA Ligase用量；

d. 连接缓冲液不合适：重新配制连接缓冲液。

3、脱氧核糖核酸酶I(abs60539)浓度、体积怎么换算？用于组织的解离该怎么用？

对于浓度、体积计算：本产品规格为1KU，酶活浓度是5U/mL，总体积则为200uL。根据说明书最后一个表格计算酶体积用量：例如1ugRNA，相应所需酶就是1U，1KU/1U=200uL/需要体积，最后计算得到0.2uL。对于动物组织解离，可以适用，具体操作步骤及使用量可参考网络文献。

4、pfAgo核酸内切酶buffer是否含有金属离子？

Buffer中不含金属离子，对于扩增反应没有任何影响。一般PfAgo酶可以兼容绝大多数PCR buffer，但普通Taq酶不兼容PfAgo buffer。

5、pfAgo核酸内切酶和Ago核酸内切酶（微球）有哪些差别？

两者状态不一样、保存条件不一样；检测方法、使用的效果几乎一样。

名词解释：

酶活性单位：在一定温度、PH及离子强度下，1h内酶解（切割）特定底物DNA，所需酶的量。采用国际单位（IU，简写为U）来统一表示酶活性的大小。

酶活性浓度：以每单位体积所含的酶活性单位数表示。目前几乎都习惯用U/L来表示液体中酶活性浓度。

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