答应我，看完再做IHC（上）

IHC实验是科研人bi备的实验技能之一，然而IHC实验流程复杂，而且经常出现假阴性的结果，常常让人头疼。为此特别给大家整理了一份IHC实验详解，原理，步骤，注意事项及操作视频一网打尽，想做IHC实验只看这篇就够了（分为上下两篇哦）。

IHC实验原理

免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)：利用抗原－抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色以确定细胞内抗原，并对其进行定位、定性及定量的研究。和WB实验相比，IHC实验可以更为直观的展现待测蛋白的表达量和位置，也常用于病理诊断。

表1 WB实验和IHC实验比较

IHC样本类型

IHC实验根据样本类型可以分为石蜡切片免疫组化(IHC-P)和冰冻切片免疫组化(IHC-F)，石蜡切片免疫组化虽然操作更加复杂，但其可以更好的保持组织的形态结构，厚度更薄便于染色和观察，以及可以常温保存多年的优点，在实验中更为常用。IHC-P和IHC-F的区别如下表：

表2 IHC-P和IHC-F实验比较

IHC实验流程

IHC-P由于前期需要用醛类固定和石蜡包埋，因此前期样品处理时需要有脱蜡复水和抗原修复的步骤，IHC-F则可以直接用OCT包埋剂包埋进行切片和固定，可省略抗原修复的过程，后面的步骤基本一致。IHC-P的实验步骤如下图所示：

PART 1 样本制备

（篇幅有限，本文仅介绍样本制备过程，后面的流程将在以后继续介绍）
石蜡组织样本的制备流程和冰冻组织样本略有不同，步骤可参考下图：
 

1、石蜡组织样本：

（1）固定：可以使用4%多聚甲醛进行在体灌流的方式，或者把组织取出之后，尽快放入4%多聚甲醛或者10%中性福尔马林中进行固定。固定液的体积一般为组织体积的20倍，固定时间为室温4-48h。组织的体积不宜过大（不超过5*5mm2），以免影响后续的操作；

（2）脱水透明：使用梯度乙醇和二甲苯对样品进行脱水和透明处理。将组织修剪后置于脱水盒内，依次放置于以下溶液中：75%乙醇（1h）——85%乙醇（1h）——95%乙醇（1h）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——100%乙醇（50min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——二甲苯（40min）——63℃石蜡（50min）——63℃石蜡（50min）——63℃石蜡（50min）；

（3）浸蜡包埋：脱水结束后放入预热的包埋机，按要求确定包埋方向进行包埋，置于冷冻台冷却；

（4）切片：将修整好的蜡块放入切片机中进行切片，切片的厚度为3-5um，将切片漂浮于40℃温水上展平组织，用粘附载玻片将组织捞起，置于60℃烘箱中进行烤片1-2h；

（5）脱蜡复水：使用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡和复水处理。将切片放置于切片架内，依次分别置于以下溶液中：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）——95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去离子水（5min)；

（6）抗原修复：

组织样本在固定时形成的蛋白间交联会限制抗体和抗原结合，需要通过抗原修复的过程使抗原暴露出来。抗原修复的方法一般分为热修复和酶解修复。

热修复：热修复可使用微波炉或高压锅对样品进行加热煮沸，常用的缓冲液为PH6的柠檬酸盐或者PH8的EDTA缓冲液。热修复适用于大多数实验，柠檬酸盐较为温和，更为常用；EDTA适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体和较难检测出的抗原。（具体修复液的选择和处理时间参考一抗说明书）

酶解修复：胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K进行酶解作用也可进行抗原修复。酶解修复易受温度影响，操作更难控制，一般适合于较难修复的抗原表位。
操作步骤：将切片置于切片架内，放入装有修复液的烧杯中，放入微波炉高火5-8min，常温5min，中火5min，室温冷却30min。

2、冰冻组织样本：

（1）OCT包埋：-80℃保存的组织提前半小时-20℃缓慢解冻后OCT包埋，固定组织经蔗糖溶液脱水后进行OCT包埋，新鲜组织滤纸吸干水分后可直接进行OCT包埋。样本脱上滴少量OCT后，将组织切面朝上置于样本脱上，组织周围滴上OCT包埋剂全部覆盖组织，将样本托放在速冻台上快速冷冻包埋，大约冷冻10-20min，OCT变白变硬后即可进行切片。

（2）切片：将样本托固定于切片机上，先粗修将组织面修切平整修到目的观察部位后即可开始切片，将组织贴于防脱载玻片上，室温晾干，37℃烤箱烘烤10-20min。

（3）固定：用4%PFA或者甲醇固定20min。