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类器官气液交互法(ALI)培养攻略

更新时间:2024-06-18      点击次数:238

概述

 

肿瘤微环境(tumor microenvironment, tme)是由肿瘤相关基质细胞免疫细胞,以及相应细胞的分泌产物(如细胞因子和趋化因子)和细胞外基质(ecm)中的非细胞成分组成的。肿瘤微环境为肿瘤提供了良好的生长环境和营养物质,促进肿瘤的进展和转移,这也是临床中导致许多个体患者常规治疗失败的原因。肿瘤类器官相对于pdx动物模型,体外培养环境相对单纯,而缺乏肿瘤微环境的类器官模型,又很难wan全模拟肿瘤对于药物的反应性,特别是免疫细胞随着肿瘤类器官的培养,会逐渐功能下降、数量减少,甚至于逐渐消失。

 

目前类器官的培养方法是机械破碎法,使用弹力剪将肿瘤组织剪成1mm3的碎片,加入培养液,在水平摇床上震荡培养。研究结果证明,随着类器官的培养肿瘤免疫细胞会大量的损失,肿瘤免疫微环境受到了很大的破坏。有文献报道采用气液交互法(air-liquid interface, ali)培养组织来源的类器官,可以在一定程度上保留组织原位的免疫微环境。今天,给大家介绍采用ALI方法培养类器官的方法。

 

培养方法

 

原代

 

一、准备工作

 

1、仪器设备

CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床,医用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、眼科剪、眼科镊。

 

2、试剂耗材(以肺癌为例)

人肺癌类器官培养试剂盒(abs9443)、基质胶(低因子、无酚红)(abs9495)、60mm细胞培养皿(abs7005)、100μm滤筛(abs7009)、15mL离心管(尖底,无菌无酶)(abs7120)、1.5mL EP管若干(abs7119)、细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)(abs7280)、金属冰盒(abs7289)、眼科剪刀、眼科镊。

 

人肺癌类器官培养试剂盒(abs9443)

 

基质胶(低因子,无酚红)(abs9495)

 


组分名称

规格

人肺癌类器官培养基A

100mL

类器官原代培养缓冲液B

250mL

人肺癌原代组织消化液C

30mL

类器官传代消化液D

30mL

组织保存液E

100mL

类器官冻存液F

20mL

类器官传代培养缓冲液G

250mL




 

二、操作步骤

 

 1、细胞小室底层凝胶基质的制备

(1)基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

(2)枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

(3)融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完。

 

低温金属冰盒(abs7289)

 

(4)在细胞培养超级净台中,用100uL枪头吸取50uL基质胶加入细胞小室(注意铺展均匀),将小室放入24孔板,将孔板放入培养箱,静置40-60min直到基质胶凝固为止。

 

2、样本准备

(1)将组织放入含有预冷的(2-8°C)组织保存液E的取样瓶中(浸没整个组织),4℃从医院/实验室取回;

(2)将取样瓶消毒,组织取出放入培养皿样本拍照,并登记,大小,颜色,软硬程度,组织类型等信息。

 

 

3、清洗-剪碎

在60mm细胞培养皿(abs7005)里用2-3mL原代培养缓冲液B浸泡。用原代培养缓冲液B清洗三次(每次更换培养皿)后剪碎,剪成大约1-3mm3的组织块,转移至15mL离心管。

 

 

4、消化-过滤

(1)向15mL离心管中加入5倍原代组织消化液C(消化液体积:组织体积=5:1,如果估量组织体积困难,使用5mL消化液通常足够)4℃进行消化15-30min(消化过程中随时观察消化情况)

(2)取少量液体在显微镜下观察,镜下观察到较多的细胞团(5-50个细胞抱团)后, 加入3倍体积原代培养缓冲液B (缓冲液体积:消化液体积=3:1终止消化,用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

 

 

(3)使用100μm滤筛(abs7009)进行过滤,取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15mL离心管,于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清。

 

 

5、加胶-点板-加液(这里是整个原代操作的点睛之笔

 

(1)准备工作

a. 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

b. 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

c. 融化后的基质胶可一直4℃储存,建议2周内用完。

 

(2)接种要求

细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)(abs7280),每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

 

(3)接种密度

密度建议1:基质胶体积:细胞团沉淀体积=25:1(如果估摸细胞团沉淀体积困难,通常加300uL基质胶足够)

密度建议2:1000个细胞团/50uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)

 

(4)加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡),向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物,(整个操作在金属冰盒或冰上进行,操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性)。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶

 

(5)加液

含组织的上层凝胶凝固以后,将24孔板放入超净台,向下培养孔加入适量类器官培养基,培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层(如下图),这样就可以形成ALI微环境。

 

(6)将培养板放于培养箱,每2天换一次液,大概10-14天,多数类器官直径在100um以上,可进行传代操作。

 

 

传代(消化分两种情况)

 

一、细胞小室底层凝胶基质的制备

 

1、基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

2、枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

3、融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完;

4、在细胞培养超级净台中,用100uL枪头吸取50uL基质胶加入细胞小室(注意铺展均匀),将小室放入24孔板,将孔板放入培养箱,静置40-60min直到基质胶凝固为止。

 

二、类器官数量较多或体积较大传代步骤

 

1、类器官收集及洗涤

 

(1)收集:用移液器吸去外培养孔的培养基,向每个细胞小室添加1mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G,轻柔吹散基质胶和类器官,收集在15mL离心管中(24孔板,每5个细胞小室孔为一组)。

(2)洗涤:加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱保温效果强,缩短冷冻时间,摸索合适的冷冻时间时,可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了)。

(3)接下来将离心管进行300g,4℃,离心5min,离心完通常会有这两种情况:

第一种是正常情况,分成三层(如下图),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况,分成两层(如下图),这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液,留下基质胶类器官混悬液,重复上一步洗涤步骤,再次冷化离心,通常能出现清晰分层(缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。如果依然是两层(缓冲液层和基质胶类器官混悬液层),此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液,保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件:

a. 离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

b. 离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g,离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

2、类器官消化

(1)添加2-3mL类器官传代消化液D于超净台内消化2-3min,消化期间吹打1-2次。此步骤以消化成细胞团为主,千万不要消化成单细胞,单细胞类器官存活率低。如果不确定是否消化适宜,可吸取数微升镜下观察,如果有较多细胞团可停止消化。

(2)添加5倍类器官传代培养缓冲液G(缓冲液:消化液=5:1)终止消化,300g 4℃离心5min弃去上清(如果有基质胶残留,残留量<50uL正常,不影响传代类器官增殖)

 

 

3、加胶-点板-加液

 

(1)准备工作

a. 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

b. 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

c. 融化后的基质胶可一直4℃储存,建议2周内用完。

 

(2)接种要求

细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)(abs7280),每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

 

(3)接种密度

密度建议1: 类器官通常按1:2传代,例如,细胞小室收集5孔,传代10孔,需要的基质胶量50*10=500uL

密度建议2:1000个细胞团/50uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议);

注意:不管是按密度建议1还是,密度建议2,如果有残留的基质胶,新胶量至少是残留胶量的1.5倍。

 

(4)加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡)向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物,(整个操作在金属冰盒或冰上进行,操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性)。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶

 

(5)加液

含组织的上层凝胶凝固以后,将24孔板放入超净台,向下培养孔加入适量类器官培养基,培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层,这样就可以形成ALI微环境。

 

(6)将培养板放于培养箱,每2天换一次液,大概7-10天,多数类器官直径在100um以上,可进行传代操作。

 

三、类器官数量不足或体积较小时:

 

1、类器官收集、吹打、洗涤

(1)收集:用移液器吸去下培养孔的培养基,向每个细胞小室添加1mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G,轻柔吹散基质胶和类器官,转移到下培养孔。

(2)进行吹打,将类器官吹成细胞团(可取样镜下观察有较多细胞团时可停止吹打)

(3)洗涤:24孔板,每5孔为一组,收集在15mL离心管中,加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱保温效果强,缩短冷冻时间,摸索合适的冷冻时间时,可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了)。

(4)接下来将离心管进行300g,4℃,离心5min,离心完通常会有这两种情况:

第一种是正常情况,分成三层(如下图),此时弃掉上清和基质胶层,保留细胞团沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况,分成两层(如下图),这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液,留下基质胶类器官混悬液,重复上一步洗涤步骤,再次冷化离心,通常能出现清晰分层(缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。如果依然是两层(缓冲液层和基质胶细胞团混悬液层),此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶细胞团混悬液,保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件:

a. 离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

b. 离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g,离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

2、加胶-点板-加液

 

(1)准备工作

a. 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

b. 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

c. 融化后的基质胶可一直4℃储存,建议2周内用完。

 

(2)接种要求

细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)(abs7280),每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

 

(3)接种密度

密度建议1: 对于类器官数量较少的情况,为了维持生长所需的旁分泌信号,需要2-3孔富集到1孔,例如,24孔板收集6孔,2孔富集1孔,铺3孔,需要的基质胶量50*3=150uL

密度建议2:1000个细胞团/50uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)

注意:不管是按密度建议1还是按密度建议2,如果有残留的基质胶,新胶量至少是残留胶量的1.5

 

(4)加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡),向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物,(整个操作在金属冰盒或冰上进行,操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性)。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶

 

(5)加液

含组织的上层凝胶凝固以后,将24孔板放入超净台,向下培养孔加入适量类器官培养基,培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层,这样就可以形成ALI微环境。

 

(6)将培养板放于培养箱,每2天换一次液,大概7-10天,多数类器官直径在100um以上,可进行传代操作。

 

冻存

 

冻存要领

类器官不需要消化(消化后的类器官复苏活率低);

在类器官指数增长期冻存(等到该传代的时候类器官活性比指数期差),也就传代后的Day3-Day4,多数类器官直径在100um-200um,这个时机选择冻存。

 

一、类器官收集及洗涤

 

1、收集:用移液器吸去下培养孔的培养基,向每个细胞小室添加1mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G,轻柔吹散基质胶和类器官,收集在15mL离心管中(24孔板,每5个细胞小室孔为一组)。

2、洗涤:加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱保温效果强,缩短冷冻时间,摸索合适的冷冻时间时,可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了)。

3、接下来将离心管进行300g,4℃,离心5min,离心完通常会有这两种情况:

第一种是正常情况,分成三层(如下图),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况,分成两层(如下图),这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液,留下基质胶类器官混悬液,重复上一步洗涤步骤,再次冷化离心,通常能出现清晰分层(缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。如果依然是两层(缓冲液层和基质胶类器官混悬液层),此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液,保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件:

a. 离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

b. 离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g,离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

二、类器官冻存

 

1、冻存密度,以细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)(abs7280)为例

密度建议12个细胞小室孔/mL冻存液

密度建议2500个类器官/mL冻存液(如果想计数冻存,可以参照此密度建议)

2、添加适量类器官冻存液 F,轻柔吹打重悬,建议立即进行冻存。(放置太久,DMSO对类器官有损伤)

3、梯度冻存:将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。

     手动冻存:4℃冰箱放置30min,转移至-20℃放置1h,然后移至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。

 

复苏

 

一、实验前准备

1、将水浴锅预热至37℃;

2、细胞实验室进行常规消毒,用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面;

3、在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。

 

二、细胞小室底层凝胶基质的制备

1、基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

2、枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

3、融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完;

4、在细胞培养超级净台中,用100uL枪头吸取50uL基质胶加入细胞小室(注意铺展均匀),将小室放入24孔板,将孔板放入培养箱,静置40-60min直到基质胶凝固为止。

 

三、取出冻存管

1、根据类器官冻存记录按标签找到所需类器官的编号;

2、从液氮罐中取出冻存盒,取出所需的冻存管,同时核对冻存管外的编号。

 

四、迅速解冻

1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻,并要不断地摇动,使管中地液体迅速融化;

2、约1-2min后冻存管内液体wan全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁,再拿入超净台内。

 

五、将类器官冻存液移入15mL离心管,添加10倍体积类器官传代培养缓冲液G(缓冲液体积:冻存液体积=10:1重悬,轻柔吹打混匀,300g 4℃离心5min,弃上清。

 

六、加胶-点板-加液

 

1、准备工作

(1)基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

(2)枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

(3)融化后的基质胶可一直4℃储存,建议2周内用完。

 

2、复苏要求

细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)(abs7280),每个细胞小室孔加入50uL基质胶细胞团混合物。

 

3、复苏密度

复苏密度建议1:1:1接种(原来冻了几个细胞小室孔就复苏几个细胞小室孔);

复苏密度建议2:500个类器官/50uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)

 

4、加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡)向每个铺了基质凝胶的小室内加入50uL细胞团基质胶混悬物,(整个操作在金属冰盒或冰上进行,操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性)。将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶

 

5、加液

含组织的上层凝胶凝固以后,将24孔板放入超净台,向下培养孔加入适量类器官培养基,培养基的水平面不得超过上面的细胞凝胶层,这样就可以形成ALI微环境。

 

6、培养

将培养板放于培养箱,每2天换一次液,大概10-14天,多数类器官直径在100um以上,可进行传代操作。

 

今天讲解就到这了,大家如有实验问题,欢迎公众号“AG8亚国服务生物"后台交流哦!

 

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货号

品名

规格

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abs9778

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1kit

abs9773

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1kit

abs9495

基质胶(低因子,无酚红)

1.5mL×4/1.5mL×8

abs7005

60mm细胞培养皿

10个/包;500个/箱(50包)

abs7009

100μm滤筛

100个/箱;1个/包

abs7120

15mL离心管(尖底,无菌无酶)

100支/袋;12袋/箱

abs7119

1.5mL离心管(无菌无酶)

500支/盒;10盒/箱

abs7280

细胞小室(PET膜,6.5mm,孔径0.4um,含24孔板)

12嵌套/块,4块/箱

abs7289

金属冰盒

1个




 

Absin产品线:
爆款产品:试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测);细胞培养(类器官试剂盒+基质胶,胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒;分子(mRNA合成服务+提取试剂盒);化合物大包装;辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
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