答应我，看完再做IHC（下）

在之前的文章中，小爱为大家介绍了IHC的原理以及样本处理的实验要点：今天我们继续看看接下来的实验流程及操作要点。首先还是先来回顾一下IHC的整体流程：

前期样品处理的过程包括载玻片的制备，脱蜡/复水，抗原修复（上期内容），然后我们需要做样品的封闭，孵育一抗和二抗，以及底物检测，最后的处理步骤包括脱水，封片和观察。PART1我们介绍了样品制备环节，今天我们继续看下PART2抗体孵育及检测。

PART2 抗体孵育及检测

（1）淬灭：如果使用基于酶或者生物素的检测系统，样本中内源性酶的活性（过氧化物酶/碱性磷酸酶）或者内源性生物素会对检测产生非特异性干扰，因此在血清封闭之前需要先对样品进行淬灭。根据使用的二抗偶联标记不同，使用对应的内源性封闭液进行淬灭。

小技巧：使用免疫组化笔在样本周围画圈建立疏水隔离区，可以避免样品间的交叉染色和节约血清和抗体的用量。
 

操作步骤：将组织切片画上阻水圈，每切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节） 3% H2O2，室温下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。

（2）封闭：使用血清对样品中非特异性结合位点进行封闭。一般建议在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作为封闭液。

需要注意如果使用酪蛋白封闭液（例如牛奶），可能会影响磷酸化抗体的识别。

操作步骤：每张切片加100μL（用量以浸没样本区域为准，可灵活调节）5%山羊血清封闭液，室温孵育30min。

（3）孵育一抗：抗体孵育可以选择直标一抗的方式或者无标记的一抗再偶联HRP标记的二抗。间接检测的方式可以进行信号放大，灵敏度更高，是更为常规的检测方式。一抗用于与样品中的靶标抗原进行特异性结合。

在选择IHC一抗的时候应注意以下几点：

1、一抗的反应种属：一抗的反应种属应与样品的种属一致，并且一抗的宿主来源不同于样品种属。例如：如果样品是小鼠的肿瘤，应选择针对于小鼠的抗体；

2、一抗的特异性：抗体的特异性不好，容易引起非特异性染色，单克隆抗体的特异性优于多克隆抗体。标记mAb的一般是指单克隆抗体；

3、查看抗体说明：查看抗体说明书上面的应用，注意有些抗体仅适用于IHC-P而不适用于IHC-F，根据样本类型进行选择；例如下面这个抗体可以适用于IHC-P。

操作步骤：在样品处加入稀释后的目的蛋白抗体，置入4℃冰箱内过夜，PBST浸洗3min×3次。

（4）孵育二抗：二抗与一抗结合，并带有偶联标记。

在选择IHC二抗的时候应注意以下几点：

a. 二抗的反应种属应与一抗的宿主来源相同；

b. 多标IHC/IF实验中，建议优先选择经过预吸附处理的二抗，可以避免不同物种间抗体的交叉反应；

c. 某些细胞和组织（巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞，淋巴结组织，脾脏组织等）表面内源性的Fc端受体过多，建议使用F(ab')₂形式的二抗以避免其与样品Fc受体非特异性结合。

操作步骤：在样品上添加对应的二抗，室温孵育1h，PBST浸洗3min×3次。

（5）底物检测：IHC通过酶和底物反应在抗体结合处显色以检测抗原表达。显色检测中需要根据抗体上的偶联标记来选择对应的底物，常见的偶联标记有HRP和AP。二抗上带有HRP标记时，一般选择DAB作为底物进行检测。

操作步骤：配制即用型DAB工作液，滴加新鲜配制的DAB工作液到切片上，wan全覆盖标本。通常显色1-10min，DAB显色时间需要镜下控制，选择最佳显色时间，做好防护。自来水冲洗终止DAB显色反应。

（6）苏木素复染：苏木素经氧化后生成苏木精，是一种碱性染料，组织学中用于细胞核的染色，染色后的细胞核呈鲜明的蓝色或蓝紫色，可以更方便的查看细胞形态。

操作步骤：滴加适量苏木素以覆盖整个组织，复染 30sec~3min。用自来水wan全冲洗掉复染液。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml盐酸）分化3-5sec后水洗30sec，终止反应。去离子水冲洗切片 3~5min，使胞核返蓝。

明星产品：免疫组化二抗试剂盒（abs957）

二抗检测试剂盒用于IHC实验，包含经过条件摸索和实验验证的最佳搭配试剂和实验方案，试剂盒中包含淬灭剂，封闭液，一抗放大剂，酶标二抗聚合物和显色底物。由于IHC实验一般信号较弱，需要信号放大，建议使用二抗检测试剂盒。

1、减少一抗用量，一抗可再稀释2-4倍；

2、Polymer酶标二抗检测系统，更低背景；

3、快速便捷，更短孵育时间，鼠兔通用；

4、单品文献100+，认可度高。

PART 3 封片和观察

（1）脱水：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、重复两次。

（2）中性树脂封片：在玻片上滴加一滴中性树脂，从侧边缓缓盖上盖玻片，动作应尽量缓慢，以防止产生气泡。

IHC常见问题

【高背景】

1、封闭问题

封闭不好是最常见的导致高背景的原因，切记要注意以下几个方面：首先封闭液的浓度我们可以适当增加，并延长封闭时间，来达到更好的封闭效果；其次容易忽略的是我们通常采用稀释的动物血清作为封闭液，这时就要注意血清的种属，最好使用与二抗同种属来源，切记不可使用与一抗同种属来源。

2、抗体浓度

有时一抗的浓度太高会导致较高的背景，因此我们可以在原有一抗浓度的基础上提高稀释度，并减少抗体孵育的时间，来达到降低背景的目的。当然这也和抗体的效价有关，记得认真查看抗体厂家的建议稀释比。

3、内源性物质影响

常见的为内源过氧化物酶和内源生物素，记得要使用H2O2和Avidin来进行封闭处理（abs9333和abs9335）。

【信号弱】

1、抗体影响

厂家在生产抗体的时候会做抗体应用检测，记得查看自己的抗体是否能运用于IHC；其次，抗体的效价较弱，这是我们可以通过提高抗体浓度来增强结果的信号；最后，大家切记在保存荧光二抗的时候要避光。

2、样本保存

应选择新鲜组织进行实验，样品取出后应尽快放入固定液中。固定液现用现配。

3、样本个体差异
从Uniprot或者Atlas网站上查看蛋白的定位，修饰等信息，并查询蛋白在不同种属和组织间的表达情况。或者可以先使用其他方法（如WB，Flow等）对样品先进行筛选或设立阳性对照。

【样本形态不好】

1、掉片问题

如果出现样本切片掉片问题，记得使用多聚赖氨酸（abs9170）处理过的玻片，可以有效防脱。另外石蜡切片要注意烤片的温度和时间，以60℃，2-4个小时为最佳。

2、固定问题

固定时一定要保证固定的时间和固定液（abs9179）的体积，固定时间至少在8小时以上，同时固定液的体积至少要是组织块的20倍左右。

3、抗原修复问题

抗原修复不要使用太过剧烈的条件，尤其是对于一些硬质组织样本，本身比较容易脱片。可以适当摸索下修复时间。

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