IHC实验难题破解：常见问题与应对策略

免疫组化(IHC)是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质表达的实验技术。这项技术在医学研究和诊断中非常重要，但实验过程中可能会遇到一些问题。让小爱带你来看看常见问题的应对策略吧~

无染色

1、一抗和二抗不兼容

- 使用抗一抗种属来源的二抗（例如，如果一抗是兔来源的，则使用抗兔的二抗）。确认二抗是否识别一抗的亚型。

2、没有足够的一抗与目的蛋白结合

- 使用更高浓度的抗体。

- 4℃下长时间孵育（如过夜孵育）。

3、抗体可能不适用于IHC，因为其可能无法识别蛋白的天然(3D)形式

- 查看抗体使用说明书，确认抗体是否经过IHC验证以及验证的IHC类型（福尔马林或PFA固定、冰冻切片等）。在ICC或IP中成功使用抗体也能说明抗体可以识别天然形式的蛋白。

- 在天然（非变性）WB中检测抗体，以确保其仍然有效。

4、一抗/二抗/信号放大试剂盒可能因储存不当、稀释不当或多次反复冻融而失去活性

- 设置阳性对照，以确保这些试剂仍然有效。

5、该蛋白不存在于目标组织中

- 设置文献中或抗体供应商推荐的阳性对照。

6、目的蛋白在组织中含量并不丰富

- 采用信号放大步骤，将信号zui大化。

7、二抗未避光保存（进行荧光检测时）

- 始终避免二抗暴露于光照中。

8、脱蜡可能不充分

- 延长切片的脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。

9、固定步骤可能会改变抗体识别的抗原表位

- 使用不同的抗原修复方法来暴露抗原表位（包括使用pH值为6或9的缓冲液进行热抗原修复、酶抗原修复等）。

- 缩短切片固定时间。

10、抗体不能穿透蛋白所定位的细胞核（核蛋白）。

- 向封闭缓冲液和抗体稀释液中加入强效通透剂（如Triton™ X-100，货号：abs9149）。

11、PBS缓冲液被细菌污染，细菌会破坏目的蛋白上的磷酸基团（磷酸化蛋白）

- 在PBS抗体储存缓冲液中加入0.01%叠氮化物或使用新配制的无菌PBS。

12、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合

- 建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

非特异染色

1、一抗/二抗浓度可能过高

- 尝试降低抗体浓度或缩短孵育时间。与不表达靶蛋白的组织的信号强度进行比较。

2、内源性过氧化物酶具有活性

- 使用酶抑制剂，即对AP使用左旋咪唑(2mM)，或对过氧化物酶使用H2O2(0.3% v/v)。

3、使用与染色组织相同种属来源的一抗（例如在小鼠组织上使用小鼠一抗）。应用二抗时，由于二抗是靶向组织种属的，与组织中的免疫球蛋白或蛋白的Fc片段结合

- 使用种属来源与组织切片不同的一抗，或用F(ab)片段二抗封闭。

4、切片/细胞已干燥

- 保持切片/细胞高度湿润，勿让其变干。

5、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色

- 建议试用单克隆抗体看看。

6、非特异性组分与抗体结合

- 这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。

组织形态不清晰或受损

1、抗原修复方法可能过于苛刻

- 改变抗原修复步骤或尝试不同的抗原修复方法。

2、组织可能未充分固定

- 延长固定时间。

- 提高固定剂与组织的比例。

- 切割更小块的组织，进行更有效的固定（浸泡固定）。

3、组织切片从载玻片上脱落（冰冻切片）

- 延长固定时间。

- 尝试更换固定剂。

- 使用新鲜制备的载玻片。

4、组织切片撕裂或折叠，或切片下方可见气泡

- 使用锋利的刀片重新切片。

- 研究不受影响的组织区域。使用PAP笔（货号：abs929）定位试剂。

5、组织形态难以分辨

- 将组织切片切的更薄。

- 冰晶可能破坏切片形态

- 重新切片，快速冷冻（冷冻切片）。

6、组织自溶

- 延长固定时间。

- 增加固定剂相对于组织的比例。

- 尝试使用交联固定剂。

高背景

1、没有对非特异性结合进行封闭或封闭不充分

- 延长封闭时间，并考虑更换封闭试剂。如果使用血清，我们推荐使用二抗种属的10%正常血清封闭1h（货号：abs933）。或者，尝试采用商品化的封闭缓冲液，或使用样本种属免疫球蛋白预吸附的二抗。

2、一抗浓度可能过高

- 测试抗体的最佳浓度，梯度稀释抗体，并在4℃下孵育。

3、孵育温度可能过高

- 4℃下孵育切片。

4、二抗可能存在非特异性结合

- 使用不加一抗的二抗对照。

- 如果在单独使用二抗时观察到着色，则应更换二抗，或使用样本种属免疫球蛋白预吸附的二抗。

5、组织洗涤不充分；仍然存在固定剂

- 各个步骤之间，用PBS或TBS充分洗涤组织。添加表面活性剂，例如0.1% Triton。

6、内源性过氧化物酶具有活性

- 使用酶抑制剂，即对AP使用左旋咪唑(2mM)，或对过氧化物酶使用H2O2 (0.3% v/v)。

7、固定步骤导致自发荧光（如果使用荧光检测）

- 福尔马林/PFA通常会在绿色光谱中产生自发荧光，因此可以尝试使用红色光谱范围内的荧光基团。

- 如果有可用的红外检测系统，则使用红外范围内的荧光基团。

8、组织内自发荧光（如果使用荧光检测）

-如果自发荧光不需要保留，可以使用组织自发荧光淬灭剂（货号：abs9860）

9、信号放大过多（间接检测技术）

- 缩短信号放大试剂孵育时间，稀释二抗或信号放大试剂。

10、底物过多（酶检测）

- 进一步稀释底物，或缩短底物孵育时间。

11、色原与组织样品中存在的PBS反应（酶检测）

- 先使用Tris缓冲液洗涤切片，再与底物一起孵育，然后在Tris缓冲液中洗涤切片/细胞（特别注意，仅适用于AP）。

IHC实验虽然在技术上要求较高，但通过仔细的实验设计、严格的操作流程和及时的问题解决，可以获得高质量的实验结果。面对IHC实验中的问题，研究人员需要耐心和细致，不断优化实验条件，以确保实验的成功。

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