深度、全面！全新的肿瘤抗原特异性T细胞含量检测

在肿瘤免疫治疗领域，特异性T细胞疗法跟传统治疗方法显著不同，具有显著的抗肿瘤效果，被认为是癌症治疗的有效方案之一。其中，小鼠T细胞特异性识别肿瘤抗原的特异性T细胞免疫疗法在抗肿瘤治疗领域具有重要作用。Absin新推出的小鼠肿瘤抗原特异性T细胞检测刺激试剂盒是一款专门用于小鼠体内肿瘤特异性T细胞检测和分析的试剂盒。该试剂盒基于先进的免疫学和分子生物学技术，通过提供特定的肿瘤抗原刺激剂，刺激T细胞增殖和活化，最终通过流式细胞术或ELISPOT定量检测激活的肿瘤抗原特异性T细胞含量，从而实现对抗肿瘤药物或肿瘤疫苗的效果评价。

多样本检测，包括：

1）小鼠外周血免疫细胞中的肿瘤抗原特异性T细胞的含量；
2）小鼠脾细胞中的肿瘤抗原特异性T细胞的含量；
3）小鼠淋巴结细胞中的肿瘤抗原特异性T细胞的含量；
4）小鼠肿瘤组织细胞中的肿瘤抗原特异性T细胞的含量；

图1 肿瘤抗原特异性T细胞

一、产品介绍

肿瘤抗原特异性T细胞是杀伤癌细胞的主力，由于癌细胞和肿瘤抗原的高度异质性，癌细胞没有一种或多种占主导的抗原，因此也就没有几种占主导的抗原特异性T细胞，而传统的使用几种多肽抗原或MHC四聚体技术等检测肿瘤抗原特异性T细胞时，只能检测针对几种已知特定抗原的抗原特异性T细胞，导致检测的抗原特异性T细胞不全面、不准确。

该试剂盒检测纳米颗粒负载癌细胞的全细胞抗原，抗原种类全面、多样和广谱，可全面准确检测不同组织中的肿瘤抗原特异性T细胞。具有特异性高，准确性高，所检测肿瘤抗原特异性T细胞种类全面等优点。

二、产品分类&组成

三、使用方法&检测步骤

1、在细胞培养皿或细胞培养板各孔中加入待检测细胞和相应的培养基，细胞浓度0.8*10⁶-5*10⁶个细胞/mL，考虑到细胞损失和流式细胞术检测的准确性，建议至少使用100万个细胞以上，建议使用12孔或24孔板培养，至少使用1-2mL以上培养基；

2、向其中加入使用PBS或相应培养基重悬后的纳米粒子；（本检测试剂盒中检测纳米粒子使用终浓度为0.5mg/mL-1.0mg/mL）

3、纳米粒子与待检测细胞共孵育32-48h；

4、在培养基中加入Brefeldin A Solution (BFA) (1000*稀释到细胞培养基中)，共孵育4h；

5、使用移液器吹打收集培养基中的悬浮细胞，收集完细胞后将样品细胞在400-500g离心5min，弃去上清液后收集细胞；

6、收集完细胞后将样品细胞重悬于1mL PBS中；

7、除空白对照之外，每个样品加入2μL活死细胞染料标记活细胞和死细胞，混合均匀，冰上避光孵育15-30min；

8、孵育完毕后，400-500g离心5min，用100μL FACS buffer重悬细胞；

9、除空白对照之外。每个样品中加2μL Fc Block封闭免疫细胞表面的Fc受体，混匀后冰上孵育5min；

10、孵育完毕后，每管加入相应的不同荧光染料标记的膜标记抗体CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体，冰上孵育15-30min；

11、直接加入500μL 4%多聚甲醛固定细胞，冰上孵育40-60min；

12、400-500g离心5min，弃去上清液，然后加100μL破膜剂重悬细胞，冰上孵育30min；

13、孵育完毕后，每管加入相应的荧光染料标记的IFN-γ抗体，冰上孵育30min；

14、400-500g离心5min，弃去上清后用200μL FACS buffer 重悬细胞或者使用500μL 4%多聚甲醛固定细胞，冰上孵育40-60min后再检测；

15、使用流式细胞术检测所标记抗体为阳性的细胞比例；（注：上机检测时需先过400目滤布之后再检测）

16、使用流式细胞术分析软件分析活细胞中的CD3+IFN-γ+ 、CD3+CD4+IFN-γ+和CD3+CD8+IFN-γ+的T细胞占相应细胞的比例，即为肿瘤抗原特异性T细胞的比例和含量（细胞越多检测越准确。建议检测时活细胞收取数大于10万，最好收集的活细胞数大于20万）。

四、注意事项

1、本产品仅为体外检测用产品，不可食用，也不可注射使用等；请放置在远离儿童可及的范围；
2、现配现用，一旦使用培养基或PBS重悬纳米颗粒后立即加入待检测细胞中混合；
3、使用过程中可根据需要自由搭配所使用的不同抗体的荧光探针；
4、请将固定后的细胞放置在4℃并于一周内完成检测；
5、本产品只适用于小鼠样本的检测。

五、实验结果

1、使用负载B16F10肿瘤组织全细胞抗原的纳米粒、负载8种B16F10的新抗原多肽的纳米粒、以及游离的B16F10肿瘤组织裂解液分别与小鼠脾细胞单细胞悬液共孵育激活肿瘤抗原特异性T细胞后，在CD3+T细胞中可以表达IFN-γ的T细胞比例，如下图所示。

图2 负载B16F10肿瘤组织全细胞抗原的纳米粒

图3 游离的B16F10肿瘤组织裂解液

图4 负载8种B16F10的新抗原多肽的纳米粒

2、小鼠淋巴结细胞和脾脏细胞检测结果，如下图所示。

图5 小鼠淋巴结细胞和脾脏细胞检测结果图

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