Balb/C小鼠正常小肠类器官培养基

使用方法：

1、原代 
（1）取材后的Balb/C小鼠正常小肠组织须在2-8°C清洗，准备若干培养皿，加入 4℃预冷的Balb/C小鼠正常小肠类器官组织原代培养缓冲液#abs9731备用（添加双抗和庆da霉素）。
（2）将组织放入培养皿中，利用Balb/C小鼠正常小肠类器官组织原代培养缓冲液清洗三次后，去除杂质，利用眼科剪或手shu刀将Balb/C小鼠小肠组织肠粘膜去除，利用眼科剪或手shu刀将组织jian切成体积约为 10-30mm3的组织块。
（3）组织用Balb/C小鼠正常小肠组织原代zuzhi消化液#abs9644消化，4℃震荡消化20-25min或静置消化40-50min，（消化过程中随时观察消化情况）。
（4）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的隐窝，加入三倍体积Balb/C小鼠正常小肠类器官组织原代培养缓冲液终止消化。
（5）使用100um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加Balb/C小鼠正常小肠类器官组织原代培养缓冲液重新重悬离心。
（6）基质胶计算：第5步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶#abs9495重悬铺板。
（7）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（8）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加Balb/C小鼠正常小肠类器官培养基（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养
（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液#abs9730放置2min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）a：类器官数量不足或体积较小时： 离心5min弃去上清，添加适量Balb/C小鼠正常小肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
         b：类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液#abs9520消化2-3min，添加Balb/C小鼠正常小肠类器官传代培养缓冲液终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量Balb/C小鼠正常小肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
（4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500ulBalb/C小鼠正常小肠类器官培养基。

3、类器官冻存
（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液放置2min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）离心5min弃去上清，添加适量Balb/C小鼠正常小肠类器官传代培养缓冲液再次重悬，300g离心5min弃去液体。
（4）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积1.4ml。
（5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏
（1）取10mlBalb/C小鼠正常小肠类器官传代培养缓冲液于15ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内wan全融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300g 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量Balb/C小鼠正常小肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
（5）基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min成胶，添加500ulBalb/C小鼠正常小肠类器官培养基。

储存/保存方法：

4°C保存，有效期3个月；-20°C保存，有效期1年。

别名：

Mouse(balb/C) Small Intestine Organoid Culture