人淋巴细胞分离液操作protocal

Lymphocyte Separation Medium（human, Ficoll-Paque ）是一种无菌的、即用型的Ficoll-泛影酸钠，能够简单快速的从少量或大量的人外周血、骨髓和脐带血中高产和高纯度的提纯淋巴细胞的一种即用型密度梯度介质。Ficoll-Paque PLUS内毒素水平非常低，小于0.12EU/ML，分离所得的细胞中95%左右为单个核细胞，细胞存活率大于90%，回收率为60%左右。

# 操作 Protocol #

一.试剂准备

1.样本体积: 4 ml（总） 

2.盐缓冲液（可用PBS或生理盐水）

A液配制

加950ml的蒸馏水溶解，用10 N HCl调节PH至7.6，zui后定容至1L。

B液配制

1体积的盐缓冲液：取1体积的A溶液与9体积的B容液混合，每次操作至少需要 20 ml /次

★每次实验需新鲜配置（可4℃保存一个星期）

二．分离步骤 

1.使用前上下颠倒数次确保淋巴细胞分离液充分混合 

2. 打开瓶盖，用移液管或注射器取淋巴细胞分离液 (4ml) 至离心管. 

3. 取稀释后的血液样本（4ml）加入到离心管中 (Fig 1)     V(血液：盐缓冲液：淋巴细胞分离液)=1：1：2

注意：轻轻加入样本形成分层，避免和淋巴细胞分离液混合

4.将离心管在18–20 °C，400g 离心 30-40 min

5. 轻轻移除上层分离液（血浆）

注：轻轻操作，避免淋巴细胞层和上层分离液混合

洗涤淋巴细胞以去除血小板操作步骤：

1. 吸取淋巴细胞层至干净的离心管，尽量减少吸取上下分层液的量（淋巴细胞分离液层会引起粒细胞污染；血浆层会引起血小板和血浆蛋白的污染）

2. 向离心管中加入至少3体积（6ml）的盐缓冲液

3. 使用巴斯德吸管轻轻吹打使淋巴细胞层与盐缓冲液充分混合

4. 使离心管在18–20 °C在60–100 g 离心 10分钟

5. 去除上层分离液

6. 再向离心管中添加6-8ml的盐缓冲液，用巴斯德吸管轻轻吹打使淋巴细胞与其充分混合

7. 18–20 °C，60–100 g 离心 10 minutes

8. 去除上层分离液即可.

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