免疫组化步骤剖析（二）

 1、血清封闭：

组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；因此需要使用封闭剂进行封闭。常用试剂为血清和BSA等。封闭血清一般是和二抗同一来源的，但不能与一抗来源一致。

 2、一抗和二抗浓度和孵育时间：

一抗孵育条件在免疫组化反应中zui重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果*；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，4度过夜（从冰箱拿出后37度复温45min）。具体条件还要摸索。二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。

3、抗体稀释液：

抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，另外还可以加NaN3防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。
4、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要。需注意：

    （1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

    （2）温柔冲洗，防止切片的脱落。

    （3）冲洗的时间要足够，才能*洗去结合的物质。

    （4）PBS的PH和离子强度的使用和要求（建议 PH 7.4- 7.6，浓度是 0.01M；中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。

5、DAB显色：

背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。

6、复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。

7、封片：为了长期保存，一般用中性树胶封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

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