Western Blot（WB）实验详解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。我们将通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：

【原理】

与 Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【分类】

western显色的方法主要有以下几种：

     i. 放射自显影                        ii. 底物化学发光ECL                        iii. 底物荧光ECF                       iv. 底物DAB呈色

现在常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

【主要试剂】

30%丙烯酰胺混合液，1.5M Tris（pH 8.8），1.0M Tris（pH 6.8）,10%SDS，10%过硫酸铵(APS)，N,N,N',N'四甲基二乙胺(TEMED)等。

【主要步骤】

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二抗、标签抗体、对照抗体；WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；细胞因子、信号通路调节剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒、呼吸爆发试剂盒；动植物提取物...