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实验室WB常见问题指南之样品常见问题

更新时间:2018-04-24      点击次数:3335

针对样品的常见问题:

Q:细胞水平要做Western Blot,多少细胞提的蛋白够Western Blot?

A:一般地5* 106就足够了。

Q: 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗,这样对Western Blot有无影响? 

A:能,没有问题的。

Q: 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?

A:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。

Q: 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?

A: 如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时建议加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

Q: 蛋白变性后可以存放多久?

A:-80℃,一两年没有问题。zui关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

Q: 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

A:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm厚度的凝胶。

Q: 接下来我准备采用DAB显色技术,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗? 

A:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点,此外如果用于磷酸化指标蛋白的检测时也不能用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含有酪蛋白。

Q:一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?

A:Western Blot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

Q: 做组织样品的western的时候,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?

A:组织样品必须进行研磨、匀浆超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择。

Q: 大分子量蛋白200 kD,在做western要注意什么呢?

A:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶建议选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

Q:蛋白的上样量有没有什么具体的要求?

A:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等, 如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超过0.3μg/mm2


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