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针对样品的常见问题：
Q：细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？
A：一般地5* 106就足够了。
Q: 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对Western Blot有无影响?
A：能，没有问题的。
Q: 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
A：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
Q: 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
A: 如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时建议加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
Q: 蛋白变性后可以存放多久？
A：－80℃，一两年没有问题。zui关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
Q: 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
A：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm厚度的凝胶。
Q: 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
A：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点，此外如果用于磷酸化指标蛋白的检测时也不能用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含有酪蛋白。
Q：一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
A：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
Q: 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
A：组织样品必须进行研磨、匀浆超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。
Q: 大分子量蛋白200 kD，在做western要注意什么呢？
A：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶建议选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
Q：蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
A：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3μg/mm2。
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