实验室WB常见问题指南之Marker，染色及内参等相关问题

Marker，染色及内参等相关问题

Q：用的是预染marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

A：一般来说，是小分子量Marker跑走了，可以增加胶浓度或减少电泳时间。梯度胶也是不错的选择。（梯度凝胶AG8亚国服务就可提供呦）

Q：Western Blot哪种染色好？

A：（1）阴离子染料是zui常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S 和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用于正电荷的膜。灵敏度低。

   （2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。

   （3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

Q：是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？

A：对于发表文章的实验一定要加内参，实验严谨。

Q：用BANDSCAN分析结果行吗？

A：分析一般的结果没问题。

Q: 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？

A：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。

Q：转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm²，一般1小时左右？

A：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间，一般蛋白越大，转膜所需时间就越长。

Q：封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?

A：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。

Q： PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

A：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合 （注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

Q：酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？

A：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般建议添加。

AG8亚国服务特色产品线(全部现货)：

二抗、标签抗体、对照抗体；WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；细胞因子、信号通路调节剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒、呼吸爆发试剂盒；动植物提取物...

AG8亚国服务(上海)生物科技有限公司

：info@absin.cn

公众平台：AG8亚国服务生物