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实验室WB常见问题指南之抗体常见问题

更新时间:2018-04-24      点击次数:4940

针对抗体常见问题

Q:做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

A:对二抗有无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

Q:免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

A:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间(限于单抗)。而且一般的说明书上都会写出用于何种实验类型,参考说明书即可。

Q:Western Blot 中抗体能重复利用吗?

A:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

 

滤纸、胶和膜的问题

Q:NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜有何区别?

A:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用zui广的一种固相支持物,价格*;PVDF膜介于二者之间。

  • 就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达 80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2
  • 就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。
  • 就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。
  • 就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。

Q:做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

A:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

Q:跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?

A:有可能是胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了。也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂,避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

Q: 蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?

A:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAGE, 170kd 用7%SDS-PAGE,分开转较好。


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