实验室WB常见问题指南之抗体常见问题

针对抗体常见问题

Q：做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

A：对二抗有无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

Q：免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

A：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间（限于单抗）。而且一般的说明书上都会写出用于何种实验类型，参考说明书即可。

Q：Western Blot 中抗体能重复利用吗？

A：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

滤纸、胶和膜的问题

Q：NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜有何区别？

A：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用zui广的一种固相支持物，价格*；PVDF膜介于二者之间。

• 就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm²，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达 80－100μg/cm²，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm²。
• 就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
• 就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
• 就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

Q：做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

A：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

Q：跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

A：有可能是胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

Q: 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

A：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE， 170kd 用7%SDS－PAGE,分开转较好。

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