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【AG8亚国服务实验小贴士】免疫组织化学

一、定义：

细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

二、分类：

根据染色在整个制片中的位置分为：包埋前染色、包埋后染色；

根据标记物种类分为：免疫荧光法、免疫过氧化物酶法、免疫铁蛋白法、免疫胶体金法；

按标记物的位置分为：

    直接法：标记物结合在直接与组织抗原发生免疫结合的特异性抗体，即抗体上；

    间接法：标记物通过其所标记的非特异抗体，即第二抗体间接地与抗体结合；

    标记物——抗体复合法。

三、原理：

免疫组化染色是引入附有标记物的外源性抗体（或抗原），使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原（或抗体）部位，标记物经呈色反应而显示待检抗原（或抗体）。

四、主要过程：

1、脱蜡水化：

切片在脱蜡前，放在APES（防止脱片用的，缺点是有低毒性） 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干或60°C恒温箱中烘烤20分钟，然后将组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min，无水乙醇浸泡 10min，更换无水乙醇再浸泡10min，然后依次95%乙醇，70%乙醇，50%的乙醇各5min，后用蒸馏水浸泡 5min；

2、清洗：先用蒸馏水温柔的冲洗一会，更换PBS冲洗5min，再用PBS冲洗5min；

3、抗原修复：

（1）微波炉加热：适用于来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本；

（2）高压热修复：适用于较难检测或核抗原的抗原修复；

（3）酶消化方法：适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement. Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

4、封闭：用和二抗来源一致的血清在保湿盒中于37℃孵育15-30min，然后甩去封闭用血清；

5、一抗孵育：

滴加适当比例稀释的一抗，将切片放在保湿盒中于4℃冰箱中过夜孵育或者温箱37℃孵育1-2个小时。

6、清洗：过夜后的切片用PBS冲洗2，冲洗3次；

7、二抗孵育：

滴加标记二抗在保湿盒中于37℃孵育30分钟。

8、清洗：切片用PBS冲洗2min，冲洗3次；

9、显色：加入显色剂显色，根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在3-10min左右，常用5min。

10、冲洗：充分冲洗10-15min,

11、复染

12、脱水透明

依次用50%， 70%， 95%酒精各5min浸泡切片，后用100%酒精浸泡10min，更换酒精浸泡10min，后用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯，再浸泡10min；

13、封片

捞出，用树脂封片，一滴/张,在其上盖上小玻片封好的组织切片，放入超净台中，打开抽风，冲一段时间，后把切片放在窗台上凉2-3天。

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