如何用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞？

　　淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液、Percoll淋巴细胞分离液。Ficoll与Percoll分离单个核细胞的方法均为密度梯度离心法。分离原理：外周血中单个核细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同，淋巴细胞分离液是一种密度介于1.075~1.090之间而近似于等渗的溶液,用它做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

如何用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞？

　　1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黃层。

　　2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液），混匀后离心200×g10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

　　3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用1％台盼蓝染色检测细胞活力（应>95％）并计数细胞。再用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1×106～2×106PBMC。