WB专栏——好的样本制备是实验成功的一半

一、蛋白提取 

样本制备是WB实验的第一步也是最重要的一步，它的操作虽然并不复杂，却有很多需要注意的细节。

根据实验需要的目标蛋白的不同，大致可以分为三种：总蛋白、膜蛋白和核蛋白。总蛋白提取顾名思义就是把组织或细胞内所有的蛋白全都提取出来；膜蛋白、核蛋白提取简单来说就是把细胞膜、细胞核上的蛋白质提取出来。

提取流程概览

不同部位的蛋白要能够提取分离，需要用到不同的提取试剂，看起来十分麻烦，AG8亚国服务的蛋白抽提试剂盒（abs9346）提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白、细胞浆蛋白、细胞膜蛋白与细胞骨架蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞浆蛋白、细胞核蛋白、细胞膜蛋白与细胞骨架蛋白的分离。

二、常见问题&解决策略

Q1 蛋白信号弱甚至无信号

在应用裂解液进行裂解的时候，除了释放出目标蛋白，也同时释放出一些酶，这些酶可能会降解我们的目标蛋白，所以需要对这部分酶进行降解。

添加合适的蛋白酶抑制剂（abs9161）或磷酸酶抑制剂（abs9162），全程低温操作，提前预冷PBS（abs961）、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。

蛋白酶/磷酸酶抑制剂推荐

如果实验过程中需要这部分酶和一些小分子蛋白，在选择裂解液的时候也要选择没有抑制剂的裂解液（abs9231和abs9239）

样品中不含待测蛋白，有太多可能性，对蛋白定位不准确，采用了错误的提取方法。

找准蛋白定位，是否需要保留蛋白的天然结构，如果需要的话在选择裂解液的时候要选择不含去垢剂或者含少量Triton-X-100的裂解液（abs9230）；不需要的话可能是RIPA试剂的浓度没有调配好，或者选择了不合适强度的RIPA。

常规裂解液对比表

如果您觉得裂解液的选择太麻烦，AG8亚国服务为您精心准备了免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（abs9116，abs9239），这两款产品的浓度是经过大量的实验验证调配出的最佳浓度，几乎适用于90%的样本制备，让您的样本制作更轻松。

裂解液推荐

* 样品蛋白含量低

* 去除高丰度蛋白，富集低丰度目的蛋白

Q2、蛋白成坨吸不上来，电泳条带形状不好

SDS LB不够，样品核酸、蛋白浓度过高

①再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；
②如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDS LB，继续煮；
③也可以对样品进行超声。

煮样不能过久，容易造成蛋白凝固，出现沉淀和水分离，只能丢弃。

Q3、出现多带现象

* 细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同    
* 使用原始未传代的细胞株，做对照实验
* 蛋白具有多种修饰形式，可能存在糖基化、磷酸化、羟基化
* 去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰
* 蛋白样本降解        
* 加抑制剂、冰上操作

蛋白样品的制备是整个WB实验最初的一步也是最关键的一步，选对试剂找对方法至关重要，AG8亚国服务将不断探索与开发优良的试剂，为您的实验保驾护航。