ELISA实验——我的OD去哪儿了？

在ELISA实验中，最担心遇到的结果，莫过于样本中检测不到想要的指标，或者是指标的吸光度落在检测限之外，这时候应该怎么做呢？

一、超出检测上限

这种情况比较常见于高表达的蛋白，稀释了一百倍还是在标准曲线之外，这时候您需要参考相关的文献，按照文献的稀释倍数去调整，但是因为样本的不同，文献的稀释倍数也并不一定适合您的样本，如果还是超出上限，继续进行稀释就可以。

二、低于检测下限——信号太弱

往往是由于目标蛋白的浓度太低了，可能是稀释倍数太高，也可能是本身目标蛋白含量就比较少。这种情况主要常见于在健康样本中对炎症因子的检测，表达含量往往极低。

解决方案：

①首先降低稀释倍数，一直降低到能够检测到有效的吸光度

②增加抗体的孵育时间。如果说明书写着抗体需要在室温孵育2小时，而得到的结果不好，尝试在室温两小时孵育的基础上再增加4°C孵育过夜，使得抗体结合，或增加抗体的量，说明书上只是推荐的量，有些样本可能需要更多的抗体，进而提高检测信号。

③将HRP浓度增加50%，或加倍，使得它在与TMB显色底物反应时产生更强的颜色。

④ELISA盒子如果不是拿到手立即做实验，保存的时候应该避光保存，使TMB底物性能。TMB孵育的时候需要把ELISA板放在黑暗中，因为TMB对光非常敏感。

⑤如果稀释倍数已经降低到样本原液，且做了实验的优化，依旧不能检测到，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，在表中可记录为0或标注低于检测下限。

如程碧珍等人[1]在用ELISA检测结核性胸膜炎患者（实验组）和非感染性胸膜积液患者（对照组）胸腔积液和血清中的IL-17时，对照组患者胸膜积液中的IL-17水平低于检测下限，浓度无法测出，但实验组能明显检测到，因此将对照组记为△，标注低于检测下限，如图所示。

如果依旧想要检测到或者需要做一个比较，可以选择灵敏度更高的试剂盒，更低的检测下限，就有更大的可能性能够检测到目的蛋白。

如果阳性对照孔都无法测到正常表达浓度，问题可能就是样品本身，是否不适用于ELISA实验，ELISA样品一般选择培养上清、血清、血浆，其他样品形式可能并不适合，此时就要考虑更换样品或者更换检测手段。

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参考文献：

[1]    程碧珍,林树勇,张俏忻,杨礼,蔡应木.IL-17与IL-23免疫轴在结核性胸膜炎免疫致病机制中的作用[J].中国校医,2014,28(05):353-355.