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absin 细胞凋亡检测试剂盒 高分文献分享

更新时间:2021-11-19      点击次数:817

本文使用了Absin的abs50001 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒产品 

概述
宿主细胞通过先天免疫激活共同调节其代谢,以对抗病毒感染。本文揭示了丝氨酸代谢在阻断抗病毒天然免疫中的关键作用,并表明丝氨酸代谢缺陷降低SAM介导的H3K27me3并促进ATP6V0d2表达,以增强YAP溶酶体降解和病毒诱导的IFN-b产生。

研究背景
先天免疫是宿主抵御微生物感染的第一道重要防线。宿主细胞通过不同类型的模式识别受体(PRR)识别病毒RNA和DNA,包括Toll样受体(TLR)、维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体和双链DNA的胞浆传感器。PRR然后招募衔接蛋白,如TRIF、MAVS和STING,以激活TBK1和/或IKKε激酶。TBK1/IKKε磷酸化IRF3和核因子κb(NF-kB)以诱导其核移位和随后的I型干扰素(IFN)(包括IFN-a和IFN-b)和炎性细胞因子的转录。在与IFN受体结合后,I型IFN激活JAK-STAT信号并促进IFN刺激基因的表达,以对抗病毒感染并协调适应性免疫。

在从头合成过程中,糖酵解衍生的3-PG可通过一系列酶促反应最终转化为丝氨酸,其第一个关键步骤由磷酸甘油酯催化脱氢酶(PHGDH)。丝氨酸促进单碳代谢,包括相互连接的代谢途径网络,促进单碳单位的转移,以生物合成核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和谷胱甘肽(GSH)。丝氨酸衍生的单碳代谢支持癌症和T细胞增殖的核苷酸合成。此外,丝氨酸通过单碳代谢促进脂多糖(LPS)介导的巨噬细胞内GSH合成或SAM介导的组蛋白甲基化产生白细胞介素(IL)-1b。然而,PHGDH介导的丝氨酸合成途径(SSP)或外源性丝氨酸是否参与抗病毒天然免疫仍不清楚。

液泡型H+腺苷三磷酸酶(V-ATP酶)是一种依赖ATP的质子泵,由水解ATP的外围V1结构域和转运质子的整合结构域组成。V-ATP酶定位于多种细胞膜上,酸化细胞内的腔室,包括内质体和溶酶体。V-ATP酶或其亚单位ATP6V0d2参与调节多种生物过程,包括蛋白质降解、促进病毒融合或消除细菌感染。然而,V-ATP酶在抗病毒免疫中的作用目前尚不清楚。

Hippo通路在器官大小控制和组织内环境稳定中起着关键作用。当该途径被激活时,Lats1/2激酶磷酸化YAP/TAZ,将其保留在细胞质中进行泛素化和降解。否则,YAP/TAZ进入细胞核并结合TEDD家族转录因子诱导基因转录。最近的一项研究表明,在病毒感染后,YAP可以阻止IRF3的二聚化,并防止IRF3易位到细胞核(Wang等人,2017年)。同时,病毒激活的IKKε可以磷酸化YAP,促进其溶酶体降解,缓解YAP介导的IFN-b产生抑制(Wang等人,2017)。血清饥饿可通过Lats1/2激酶使YAP/TAZ失活,从而减弱YAP介导的TBK1抑制并增强抗病毒IFN-b反应。然而,目前还不清楚颗粒代谢途径是否能与Hippo YAP途径沟通以调节抗病毒天然免疫。


文中所用实验
方法
质粒与转染
酶联免疫吸附试验(ELISA)和丝氨酸测量
蛋白分离及免疫印迹分析
RNA提取、RT-PCR和RNA序列分析
病毒体内感染
肺组织学
病毒感染和菌斑试验
荧光素酶报告试验
代谢物的B LC-MS分析
染色质免疫沉淀(芯片)
流式细胞术


文章分为6个研究部分

  • PHGDH通过抑制TBK1-IRF3轴负性调节IFN-b信号

  • 丝氨酸代谢拮抗病毒诱导的IFN-b产生

  • 丝氨酸代谢缺陷保护小鼠免受病毒感染

  • 来自丝氨酸代谢的SAM损害IFN-b的产生

  • PHGDH通过下调ATP6V0d2部分抑制IFN-b的产生

  • ATP6V0d2在病毒感染时通过促进YAP的溶酶体降解诱导IFN-b产生


研究结论
丝氨酸代谢对抗病毒天然免疫的影响。首先,我们表明,病毒感染后,小鼠巨噬菌体和HEK293T细胞的从头丝氨酸生物合成途径明显下调。通过基因调控或使用抑制剂CBR-5884治疗,靶向SSP中的关键酶PHGDH的活性,在体外和体内有力地增强IFN-b介导的抗病毒天然免疫。此外,外源性丝氨酸和甘氨酸限制也通过在体外和体内增强IFN-b来减轻病毒感染。在机制上,我们发现抑制内源性和外源性丝氨酸代谢通过降低SAM介导的H3K27me3促进ATP6V0d2的表达。ATP6V0d2针对YAP进行溶酶体降解,以减弱YAP介导的对TBK1-IRF3轴的抑制,并增强IFN-b介导的抗病毒天然免疫。
综上所述,我们的发现不仅阐明了磷酸脱氢酶(PHGDH)/丝氨酸在控制抗病毒信号通路中发挥关键作用的一种以前未知的机制,而且还提出了操纵丝氨酸代谢作为一种潜在的抗病毒治疗方法。


文中所用流式细胞:

收集并过滤Phgdhfl/flLyz2 Cre+和Phgdhfl/flLyz2 Cre-小鼠的腹腔巨噬细胞,以制备单细胞悬浮液。为了检测两种小鼠基因型中腹腔巨噬细胞的分化和数量,用含有1%FBS的冰冷PBS清洗细胞,与APC抗小鼠CD11b抗体和PE/Cyanine5抗小鼠F4/80抗体在冰上孵育15分钟,然后使用数字BD口径流式细胞仪(BD Biosciences)进行FACS。用碘化丙啶和Annexin-V-FITC(Absin)对感染SeV的腹腔巨噬细胞进行凋亡检测。通过流式细胞术获取数据,并使用FlowJo(Tree Star)进行分析。

用PI和膜联蛋白V染色分析SeV感染小鼠PMs 6h后的细胞凋亡。


文章中使用Absin产品

货号名称规格
abs50001Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒25T/50T/100T

 

Absin特色产品线(全部现货):
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