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概述

DHA是一种半合成衍生物，是C15H22O₅的主要活性代谢产物。本研究的目的是在体内和体外模型中研究DHA对溃疡性结肠炎（UC）的影响。体重、存活率、结肠长度和疾病活动指数评分用于评估结肠炎的严重程度。采用逆转录定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测细胞因子白细胞介素1、白细胞介素1β、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10、白细胞介素12和肿瘤坏死因子α的表达。western blot分析检测Janus激酶2（JAK2）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）的表达，以及JAK2（p-JAK2）和STAT3（p-STAT3）的磷酸化。westernblot分析和免疫组化检测紧密连接蛋白的表达。

此篇文章发现右旋糖酐硫酸钠（DSS）+DHA组小鼠的体重和结肠长度分别显著低于DSS组和长于DSS组。与DSS组相比，DSS+DHA和DSS+5-氨基水杨酸（5-ASA）组中IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的表达降低，而IL-4和IL-10的表达显著上调。DHA显著增加闭塞带-1和闭塞素的表达。Western blot分析和/或免疫组织化学染色分析表明，DSS+DHA和DSS+5-ASA组中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3的表达显著低于DSS组。DHA对UC有特殊的治疗作用。DHA的抗炎机制与阻断JAK2/STAT3信号通路有关。这些发现为DHA可能是一种有用的药物提供了证据，并有望成为治疗人类UC的一种有希望的新疗法。

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研究背景

炎症性肠病（IBD）是一种以慢性和复发性炎症为特征的免疫介导疾病，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病，症状为腹痛、腹泻、大便出血和体重减轻。其发病率和流行率在全球范围内不断上升。其中UC以粘膜炎症复发为特征，病变主要位于直肠和近端结肠。目前UC的治疗干预主要集中在诱导和维持临床缓解。IBD的确切病因尚不清楚。，肠道细菌、生活习惯和遗传因素都会导致疾病的发展。目前用于治疗UC的药物主要包括氨基水杨酸（ASA）、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制品。由于疗程较长，他们的治疗通常受到不良事件的限制。当停止治疗时，疾病经常复发。此外，这些药物并非对所有患者都有效。这种疾病需要新的更有效的治疗方法。

双氢C15H22O₅（DHA）是一种半合成衍生物，是C15H22O₅的主要活性代谢产物，C15H22O₅是从中草药青蒿中分离出来的天然产物。DHA是*且耐受性良好的药物，具有疗效高、副作用低、成本低等优点。DHA是C15H22O₅家族的衍生物，也是世界卫生组织推荐的一线抗疟药物之一。DHA已被证明具有抗病毒和抗菌作用，也是一种有效的免疫调节剂。

DHA具有抗炎和抗肿瘤功能。先前的一份报告表明，DHA通过调节激活IBD进展的信号转导和转录激活因子3（STAT3）和核因子κB（NF-κB）信号通路，抑制黑色素瘤细胞、食管癌细胞和其他恶性肿瘤细胞的生长。

在本研究中，我们假设DHA可能通过类似的机制抑制UC的进展[10]。虽然已经应用了一些治疗方法来控制IBD的发展，但一些IBD患者仍可能发展为结直肠癌。IBD目前被认为是一种自身免疫性疾病，如果不能有效治疗，可能会发展为结肠癌。由于IBD的治疗需要长期药物治疗，DHA可能是治疗UC的一种有希望的候选药物。在此，我们研究了DHA对右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的UC体内模型的影响，并探讨了其潜在机制，其中涉及Janus激酶2（JAK2）/STAT3信号通路。

实验过程

1. 小鼠实验性结肠炎模型的建立

2. 结肠的组织学分析

3. 细胞培养

4. 细胞活力测定

5. Annexin V染色

6. ELISA检测

7. 免疫组化染色

8. 蛋白质印迹分析

9. RNA提取与实时定量PCR

10. 统计分析

实验结果

1.DHA改善DSS诱导的体内结肠炎

为了阐明DHA在慢性结肠炎中的作用，我们观察了DHA对DSS诱导的慢性结肠炎的影响（图1A）。与DSS诱导的结肠炎小鼠相比，用DHA和5-ASA治疗的小鼠显示出显著减少的炎症反应。DSS组小鼠的体重显著低于对照组。但是20只老鼠的体重 mg/kg DHA和10 mg/kg 5-ASA组显著高于DSS组（图1B）。DSS诱导的慢性结肠炎可使小鼠结肠缩短。DAI是评价疾病活动性的重要指标。根据从体重减轻、腹泻和血便百分比中获得的DAI，DSS组的DAI显著高于对照组，而DSS+DHA组和DSS+5-ASA组的DAI低于DSS组（图1C）。DSS组的结肠长度明显短于对照组。DSS+DHA组和DSS+5-ASA组的结肠缩短显著减少（图1D，E）。

图1.DHA对DSS诱导的结肠炎临床症状的影响 

（A）DSS诱导小鼠慢性结肠炎的动物模型。（B）体重变化。（C）DAI评分计算为第51天体重减轻评分、腹泻评分和粪便血评分的平均值。（D）UC模型中收集的冒号。（E）四组结肠长度的差异。数据以平均值±标准差表示与对照组相比，P<0.001与DSS组相比，P<0.01，P<0.001。N = 10

未经治疗的结肠炎动物结肠切片的组织学评估表明，DSS诱导的结肠炎的特征是粘膜结构丧失、结肠壁增厚、溃疡形成和结肠粘膜广泛的炎性细胞浸润（图2A）。DHA和5-ASA治疗可抑制这些病理症状和组织的逐渐恢复，减少粘膜和粘膜下层的炎性细胞浸润，并保持结肠粘膜的完整性（图2A）。未经治疗的结肠炎小鼠用肉眼观察到局部结肠粘膜溃疡、充血和水肿，而经DHA和5-ASA治疗的结肠炎小鼠的这些症状有所改善（图2A）。此外，DSS+DHA组和DSS+5-ASA组的组织学评分显著低于DSS组（图2B）。总的来说，这些结果为DHA在小鼠UC治疗中的保护作用提供了第一个证据。

图2.DHA对DSS诱导的结肠炎结肠的影响 

（A）不同组结肠切片的代表性H&E染色图像。比例尺：200 μm.（B）不同组的组织学评分。（C）四组小鼠结肠切片中JAK2的免疫组织化学染色。（D）四组小鼠结肠切片的免疫组织化学ZO-1染色。（E）临床IBD患者结肠活检中ZO-1和JAK2的免疫组织化学染色。数据以平均值±标准差表示与对照组相比，P<0.01与DSS组相比，P<0.05，P<0.01。N = 5.

2.DHA增加肠紧密连接蛋白和ZO-1的蛋白表达

紧密连接蛋白中闭塞素和ZO-1的表达与IBD的发生和发展密切相关[32]。为了研究DHA是否能修复慢性结肠炎小鼠肠道中受损的紧密连接蛋白，采用western blot分析检测闭塞素和ZO-1的表达。如图3A所示，DSS组中闭塞素和ZO-1的蛋白表达水平显著低于对照组。与DSS组相比，DHA组和5-ASA组的闭塞素和ZO-1的蛋白质表达水平显著增加（图3C，D）。逆转录（RT）-qPCR（图3B）和免疫组织化学染色（图2D）结果表明，DSS+DHA和DSS+5-ASA组的ZO-1表达在mRNA水平和蛋白质水平上均强于DSS组。为了验证免疫组化结果的准确性，我们选择了一名临床IBD患者的肠组织进行ZO-1免疫组化染色，并获得了类似的结果。这些结果表明，DHA增加了慢性结肠炎小鼠肠道紧密连接蛋白occludin和ZO-1的蛋白表达。

图3.DHA对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织紧密连接蛋白的影响

（A）ZO-1和闭塞蛋白表达的Western blot分析。（B）四组小鼠结肠组织匀浆中ZO-1mRNA的相对表达。（C，D）ZO-1和闭塞蛋白的定量分析。数据以平均值±标准差表示与对照组相比，P<0.01与DSS组相比，P<0.01。

3.DHA保护与THP-1细胞共同培养的炎症模型中Caco-2细胞的细胞活力

为了探讨DHA是否对炎症环境中的肠粘膜具有保护作用，我们建立了一个在稳态或炎症状态下肠内分化的Caco-2细胞和分化的THP-1细胞的体外共培养模型。CCK-8检测结果显示，Caco-2细胞的活力在20或40%之间 µM DHA组高于模型组（图4C）。流式细胞仪检测结果显示，20、40周龄组Caco-2细胞凋亡率明显高于对照组 µM DHA组与模型组相比无统计学意义（图4A，B）。DHA处理的Caco-2细胞的存活率高于模型组，表明DHA对体外模拟的肠粘膜具有保护作用。然而，在20个细胞中，Caco-2细胞的生存能力 µM DHA组高于40%组 µM DHA组，表明20 µM DHA保护的Caco-2细胞模型比40μM DHA更有效地模拟肠粘膜 µM DHA。

图4.DHA对体外共培养模型的影响 

（A，B）四组体外共培养炎症模型中Caco-2细胞的凋亡率。（C）四组体外共培养炎症模型中Caco-2细胞的细胞活力。（D-I）四组体外共培养炎症模型基底外侧侧细胞上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α的水平。数据以平均值±标准差表示与对照组相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001#与模型组比较，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

4.在体外共培养炎症模型中，DHA抑制THP-1巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和IL-17，并促进IL-4和IL-10的产生

为了探讨DHA是否减少Caco-2细胞和THP-1细胞体外共培养模型中模拟的炎症反应，使用ELISA试剂盒测定了在体外炎症模型中共培养的基底外侧侧巨噬细胞（分化的THP-1细胞）产生IL-1β、IL-6、IL-17、IL-4、IL-10和TNF-α的情况。DHA（20或40 µM）预处理减少了IL-lβ、IL-6和IL-17的产生（图4D、F、H），而DHA增加了IL-4和IL-10的产生（图4E、G）。有趣的是，在每个实验组的共同培养炎症模型的基底外侧，TNF-α水平没有显著差异（图4I）。这些结果表明，DHA增加了体外共培养炎症模型中抗炎细胞因子的水平，降低了促炎细胞因子的水平，表明DHA可以降低体外共培养炎症模型中的炎症反应。

5.DHA对细胞因子表达的影响

为了验证DHA对DSS诱导的小鼠慢性结肠炎炎症反应的影响，我们通过ELISA和RT-qPCR测定了细胞因子的表达。ELISA结果显示，DSS组中的IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α水平高于对照组，但DHA处理后显著降低（图5A、C、E、F）。DSS+DHA组的IL-4和IL-10水平显著低于对照组，但高于DSS组（图5B，D）。RT-qPCR结果显示，DHA和5-ASA组中IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的mRNA水平显著高于对照组，但低于DSS组（图5G、H、J）。另一方面，与DSS组相比，DHA处理显著刺激IL-10 mRNA的表达（图5I）。这些结果表明，DHA抑制UC促炎细胞因子的表达，促进抗炎细胞因子的表达。

图5.DHA对DSS诱导的结肠炎细胞因子产生和表达的影响 

（A–F）四组小鼠外周血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α的浓度。（G–J）四组小鼠结肠组织匀浆中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-αmRNA的相对表达。数据以平均值±标准差表示*与对照组相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001与DSS组相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。.

6.DHA对DSS诱导的小鼠慢性结肠炎中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

如图6A、B、E所示，与DSS组相比，DHA显著降低JAK2和STAT3的表达。此外，我们对JAK2进行了免疫组织化学染色，并获得了类似的结果（图2C）。为了验证免疫组化结果的准确性，我们选择临床IBD患者的肠组织进行JAK2免疫组化染色（图2E），并获得与DSS组相似的结果。实验性结肠炎小鼠治疗后，p-JAK2/JAK2比率降低（图6D）。然而，DSS组小鼠结肠粘膜中磷酸化JAK2（图6C）和磷酸化STAT3（图6F）的水平上调，这与对照组、DSS+DHA组和DSS+5-ASA组相反。p-JAK2/JAK2（图6D）和p-STAT3/STAT3（图6G）的比率反映了p-JAK2和p-STAT3的水平，表明DHA抑制了JAK2和STAT3的磷酸化。

图6.DHA对信号转导子和转录激活子JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的影响

（A）AK2、p-JAK3、STAT3和p-STAT3蛋白的蛋白质印迹分析。（B）JAK2蛋白的定量分析。（C）p-JAK2蛋白的定量分析。（D）p-JAK2/JAK2的比值。（E）STAT3蛋白的定量分析。（F） p-STAT3蛋白的定量分析。（G） p-STAT3/STAT3的比率。数据以平均值±标准差表示与对照组相比，P<0.05，P<0.01与DSS组相比，P<0.05，P<0.01。

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