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免疫共沉淀实验·基础篇

更新时间:2022-12-29      点击次数:1449

What is Co-IP?

Co-IP全称Co-Immunoprecipitation,中文学名免疫共沉淀,是一种以抗体和抗原识别专一性为基础,用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。

通俗点来说,假设我们需要研究样品中A蛋白和B蛋白之间是否存在一些相互作用,首先我们通过合适的方法处理样本,将蛋白提取出来(同时不能破坏蛋白之间的相互作用),然后用预先结合了琼脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗体捕获样本中的A蛋白,那么与A蛋白结合的B蛋白也能一起沉淀下来。再将蛋白从珠子上裂解下来,对B蛋白进行检测,能检测到,说明B蛋白在之前的沉淀过程中随着A蛋白一起被拉下来了,进而证明二者之间存在相互关系。


How to do?

实验流程

 

A few tips:

※ 如何理解文献中的结果?

 

各名称解析:

IB:全称immunoblotting,即免疫印迹,也就是常规的Western Blotting,用于显示目的蛋白。

IP:全称immunoprecipitation,即免疫沉淀,这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。

Input:全细胞裂解液,含有细胞内所有的蛋白,可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞裂解液,在做IP实验之前,需要先跑WB,确认样本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A:A蛋白的免疫共沉淀抗体

IgG:Anti-A的同型对照抗体,即跟Anti-A同来源同种型,如Anti-A是兔来源IgG型,则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG(abs20035)

结果图解析

该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。本实验一共分为两大组:Input组及IP组,其中IP组又分为IgG组(阴性对照组)和实验组,并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。由Input组的条带可以得到结论:蛋白A与蛋白B都是存在的,证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验,结果蛋白A与蛋白B均没有条带,说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来,证明蛋白A和B与IgG没有结合,排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性;而实验组蛋白A和B均有条带,表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验,成功把蛋白A沉淀下来了,与此同时蛋白B也被沉淀下来,进而得到结论:蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。

※  试剂盒写着50T,意思是能做50次Co-IP实验?

确切来说,试剂盒的50T代表着能够完成50次免疫沉淀反应,而实际上免疫共沉淀实验需要设置多个组别进行对照验证,因此具体能够完成多少次Co-IP实验由设计方案决定,一般至少需要设置阴性对照、阳性对照、实验组三个组别。

※  预清除步骤的作用是什么?必须要进行吗?

这个步骤的目的是为去除样本中可与protein A/G琼脂糖珠非特异结合的蛋白质,减少干扰,非必做,如CoIP实验中发现有较多杂带,可考虑做一下;但应注意,选择此步骤后,需要消耗琼脂糖珠,后续能够进行免疫沉淀的次数也相应减少。

※  阴性对照IgG组出现条带是什么原因?
首先需要排除lgG和后续WB一抗同源导致的轻重链的干扰条带(25kd和50kd附近);再者建议进行预清除实验以排除Protein A/G的非特异性结合;再就是考虑lgG的问题可以换用其他品牌lgG尝试。

 

※  出现假阳性结果该怎么排除?
假阳性结果需要设置对应的阴性对照组一一排除,假设实验组为琼脂糖珠+抗体X+靶蛋白X+抗体Y+目的蛋白Y:

可能出现假阳性结果的成因

对照组设置

琼脂糖珠与X蛋白发生非特异结合

琼脂糖珠+抗体X+抗体Y

琼脂糖珠与Y蛋白发生非特异结合

琼脂糖珠+蛋白Y

抗体X和目的蛋白Y非特异性结合

琼脂糖珠+抗体X+蛋白Y

抗体的非特异性结合

IgG+蛋白X+蛋白Y


※  最后的实验结果是阴性的,是否能说明两个蛋白之间无相互作用?

对于内源性Co-IP实验,阴性结果不能说明无相互作用,也有可能是蛋白在细胞内表达过低导致,因此建议先做过表达Co-IP作为对照。


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