mRNA技术应用——传染病疫苗

早在30多年前，科学家们就构思出基于 mRNA 的核酸疫苗，能够开发出安全和多功能的核酸疫苗。如今随着mRNA技术的不断发展，这一愿望终于照进现实，新冠mRNA疫苗开发成功并投入生产，推动了mRNA疫苗在他传染病领域、癌症、罕见病等领域的研发进展。

2021年8月25日，Nature Reviews Drug Discovery发表了一篇深度综述，详细介绍了mRNA疫苗的技术基础，以及传染病mRNA疫苗开发的最近进展和关键问题。

图1
 

在这篇综述中，作者描述了 mRNA 疫苗的技术基础，包括 mRNA 设计和合成，以及递送技术并强调了正在进行的平台优化工作的主要焦点。之后概述了针对流感、寨卡病毒和呼吸道合胞病毒 (RSV) 等多种传染病的 mRNA 疫苗的开发进展，并讨论了该平台未来面临的关键问题，包括安全性、反应持续时间、在特定人群中的应用和实现疫苗可及性。
 

mRNA疫苗的主要包含人工合成的mRNA分子，它们指导抗原的产生，从而激发免疫反应。mRNA的结构主要包括5个部分，从5’端开始，分别是5’cap，5’非转录区（UTR），编码抗原的开放阅读框，3’UTR和poly A尾巴。每个部分对于mRNA疫苗的正常工作都至关重要。

5’端帽的作用之一是防止mRNA被细胞中识别病毒RNA的传感器发现，从而预防意外的免疫反应。它还在空间上保护mRNA免受核酸外切酶的降解。3’ poly A尾的长度间接调节mRNA的转译和半衰期。5’和3’UTR调节mRNA的转译、半衰期和细胞内定位。对UTR的工程化设计可以改变mRNA的细胞定位，或者降低mRNA的降解。

图2 mRNA结构的5个部分^[1]

编码抗原的开放阅读框是最重要的一部分。这一部分的改良包括对mRNA密码子的优化，将不常用的密码子转换为编码同一氨基酸的常用密码子可以提高转译水平。例如，CureVac公司的SARS-CoV-2 CVnCoV就使用了密码子优化。

提高翻译效率的另一个措施是引入修饰核苷，例如假尿嘧啶，N1-甲基假尿嘧啶等核苷。使用修饰过的核苷能够防止模式识别受体的识别，降低免疫原性，增加翻译。Moderna和辉瑞/BioNTech的mRNA SARS-CoV-2都使用了修饰过的核苷。

除了改进 mRNA 序列外，在简化 mRNA 生产方面也取得了重大进展。目前临床使用的合成mRNA使用噬菌体 RNA 聚合酶 T7从质粒DNA转录而成。mRNA的poly A尾序列已经编码到质粒DNA中，从而减少了反应步骤，在降低生产时间的同时减少了材料损失。将poly A尾序列加入到质粒DNA中同时解决了poly A尾合成长度不一的问题。通常，poly A尾长度超过100个碱基对于治疗性mRNA效果很好，然而过长的多腺嘌呤序列会破坏用于转录的质粒DNA。克服该稳定性问题的解决方案是在poly A尾中添加UGC序列接头。辉瑞/BioNTech的SARS-CoV-2 BNT162b2就使用了这种接头。

总之，这些创新克服了生产瓶颈，并促进了一种简单、经济高效和可扩展的一步 mRNA 合成工艺的开发。
 

因为mRNA是一个包含负电荷的大分子，它无法穿过由阴离子脂质双层构成的细胞膜，此外在体内，它会被先天免疫系统的细胞吞噬并被核酸酶降解，因此它的体内应用需要使用递送载体。目前的递送载体包括以下几种类型：

一、脂质纳米颗粒

脂质纳米颗粒（LNP）是目前临床上*的mRNA递送技术，目前所有获得授权使用的新冠mRNA疫苗均采用LNP作为载体。LNP具有多种优势，包括易于配制、具有模块性、生物相容性和mRNA载荷水平高。

LNP通常包含四种成分，可电离脂质（ionizable lipid）、胆固醇、辅助磷脂和PEG化脂质分子。它们结共同封装保护脆弱的mRNA分子。

图3 脂质纳米颗粒的主要脂质成分^[1]

可电离脂质分子可以说是LNP中最重要的成分，它们在酸性环境下携带正电荷，让它们可以与携带负电荷的mRNA结合生成LNP。在生理pH值时它们呈中性，这提高了它们的安全性，并且延长了它们在血液循环中的驻留时间。在被细胞吞噬进入内体后，内体的酸性环境会让它们重新携带正电荷，从而促进与内体细胞膜的融合，将mRNA释放到细胞质中。
 

胆固醇通过填充脂质之间的间隙来提高纳米颗粒的稳定性，并且帮助脂质体与内体细胞膜的融合。
 

辅助脂质分子调节纳米颗粒的流动性，并且辅助与内体的细胞膜融合。
 

PEG化脂质可稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒的大小，并通过降低与巨噬细胞的非特异性相互作用来提高纳米颗粒的半衰期。
 

二、复合物和聚合物纳米粒子

尽管在临床进展不如LNP迅速，但是聚合物与脂质具有类似的优势，并能有效递送mRNA。阳离子聚合物可以与mRNA形成不同大小的复合体。目前已经有多种可以被生物降解的聚合物材料用于有效递送mRNA，如聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、聚酰胺基胺。

图4 递送mRNA的聚合物纳米颗粒^[1]

三、其它递送系统

除了基于脂质和聚合物的载体外，多肽也可以被用于递送mRNA，主要归功与其主链和侧链中的阳离子或双亲性胺基团，可以与mRNA结合。

最后，基于角鲨烯（squalene）的阳离子纳米乳液也被用于递送mRNA。这些纳米乳液由一个基于角鲨烯的核心和一个脂质外壳构成。mRNA被吸附在纳米乳液的表面。有些角鲨烯的配方可以起到佐剂的作用。例如诺华的MF59在FDA批准的流感疫苗中作为佐剂。MF59导致注射部位的细胞分泌趋化因子，募集抗原呈递细胞，诱导单核细胞分化为树突状细胞，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取。

图5 递送mRNA的阳离子纳米乳液^[1]

在mRNA技术的临床应用方面，针对传染病的疫苗开发是进展最快的方向。综述指出，截至2021年6月18日，目前进入临床开发阶段的102种SARS-CoV-2中，有19款为mRNA疫苗。在SARS-CoV-2之外，多款mRNA疫苗也已经进入临床开发阶段，用于预防流感病毒、巨细胞病毒（CMV）、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、狂犬病毒等病原体的感染。针对不同的病原体，mRNA疫苗的开发也会遇到不同的挑战。包括病毒突变迅速（HIV病毒），高致死性（狂犬病毒），新病毒株和突变体的产生（流感病毒和SARS-CoV-2）等等。因此mRNA疫苗的设计也需要做出相应的调整，包括靶向抗原中保守的区域，携带多种突变体或者病毒株的抗原等等。

图6 针对不同病原体开发mRNA疫苗面对的挑战和应对策略^[1]

一、抗体反应的持久性

有些mRNA递送系统主动靶向抗原呈递细胞，让它们成为生产抗原的“细胞工厂”。通过在LNP表面偶联单克隆抗体或者与树突状细胞特异性结合的配体，在主动递送mRNA进入抗原呈递细胞方面已经获得可喜的效果。此外，通过延长抗原性 mRNA 的翻译来改变疫苗的药代动力学已成为增强抗体反应的令人兴奋的工具。

二、针对新兴病毒变体的疫苗开发

病毒基因组在复制时常常会发生突变。虽然大部分突变对病毒的功能没有影响，但是有些突变可能增强免疫逃逸，限制疫苗的效力。目前，针对病毒突变的创新策略包括开发靶向病毒保守区域的疫苗；或者让疫苗编码广谱中和抗体。

三、安全性

总体来说，mRNA疫苗的安全性特征良好，在临床试验中只发现轻度或中度不良事件。综述指出，疫苗造成的过敏反应在接种辉瑞/BioNTech SARS-CoV-2人群中出现的比例大约为每百万次接种中出现4.7例，Moderna疫苗这一数值为2.5例/百万次接种。这个数值是更为传统的疫苗的2-4倍。一种假设是过敏反应归因于LNP中使用的PEG化脂质分子。由于人们此前使用过很多包含PEG的日用产品（例如牙膏、洗发露等等），身体中已经存在针对PEG的抗体。这些抗体可能提高过敏反应出现的可能性，并且限制疫苗的效力。因此，mRNA疫苗开发领域需要对疫苗配方导致过敏反应的机制有更深入的了解，从而改进配方，提高安全性特征。
 

四、特定人群的疫苗接种

孕产妇、儿童、老年人等特定人群由于其免疫系统的不同，一些病毒对其会产生更严重的影响，而mRNA疫苗在该类人群中的使用也需要进一步的纵向评估。

五、疫苗的可及性

疫苗的可及性是达到广泛保护目的面对的最大挑战，特别是在低收入国家。对于已经获得授权的mRNA SARS-CoV-2来说，可及性进一步受到冷藏条件的限制。如果要对几十亿人进行接种，则需要耐热性更好的疫苗。
 

六、展望未来

mRNA 设计和核酸递送技术数十年的进步，以及新抗原靶点的发现，使 mRNA 疫苗成为对抗新兴流行病和现有传染病的非凡工具。相信随着科学的进步和技术的发展，mRNA技术能够获得更为广泛的应用，造福广大病患！

【1】Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov. 2021 Nov;20(11):817-838. 
 

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