多重荧光免疫组化Q&A（第二弹）

Q1：为什么每染一个抗体就要做抗原修复呢，我可以只在第一个指标做，后面不做吗？

A1：不可以的，每染完一个抗体都是需要做抗原修复的。染第一个抗体之前做抗原修复，是为了使被石蜡或者固定剂封闭的抗原决定簇重新暴露出来，使得抗体能够识别到抗原；在染后面每一个抗体之前的抗原修复，目的是为了去除掉上一轮染色的抗体和残留没有结合上的染料，其实更准确的叫法是“抗体洗脱"，因为我们做多色实验，没有限制一抗的来源，您的一抗可能都是来源于兔子，那我们对应每一个一抗所使用的二抗都是抗兔，如果不洗脱前一个一抗，染第二个抗体的时候，二抗也会和上一轮的一抗结合，产生大面积非特异性染色，所以抗体洗脱是整个多色实验不能缺少的核心步骤。

Q2：抗原修复液（抗体洗脱液）每一轮修复都要更换吗？

A2：需要的，首先我们的抗原修复液需要根据下一轮要染的一抗来选择，有的一抗需要用柠檬酸修复，有的又需要EDTA修复，抗体厂家往往会注明他们的抗体需要用什么修复液；其次，就算我们所有的一抗都是推荐用柠檬酸修复，但每洗脱完一个指标，修复液中都会残留上一个指标的抗体，如果重复使用修复液，会对后面的指标产生影响，导致非特异性染色。

Q3：我的组织有自发荧光，我还能做多色吗？

A3：一般情况下是可以的。首先，您可以用荧光成像设备直接观察您白片（不做任何处理的组织切片）的自发荧光情况，可以每一个通道都成像试试，看看自发荧光具体是在哪个或者哪些通道能够观察到；确定了自发荧光大概的波长范围以后，我们在选择多色染料的时候，要避开自发荧光所在的波长，比如您的自发荧光在FITC通道能够观察到，在其他通道都没有，那对应Absin多色染料有重合的就是TSA520，在染多色的时候只要不选TSA520即可。当然我们为了避开自发荧光通道，势必要舍弃一些染料，那最后能染的颜色数量也会相应减少，并且假如您发现样本在您仪器的所有荧光通道都能观察到信号，那这个样本就不适合用来做多色了，需要重新制备样本。

Q4：微波修复，高压修复，抗体洗脱液洗脱，这几种修复方式做出来的染色效果差别大吗？

A4：修复方式对染色效果的影响其实视一抗和样本来定。对于大部分的石蜡样本，我们推荐用高压热修复，这种修复方式是大家一直认为比较好的修复方式，Absin实验室一直采用的也是高压热修复，当然微波热修复效果也不错，但不同微波炉的性能不同，所以工作条件不能复刻，需要做一些摸索，并且微波热修复可能会持续比较长的时间，容易导致修复液蒸干影响效果。而抗体洗脱液主要是针对一些无法采用热修复或者热修复容易脱片的样本（如冰冻切片、硬骨切片等），工作条件更温和，洗脱效果则取决于切片厚度、洗脱温度和时间、一抗种类（洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白 > 胞浆蛋白 > 胞核蛋白）。对于能够经得起多轮热修复的样本，我们更推荐采用热修复。

Q5：做多色实验，除了多色试剂盒以外，我还需要准备什么材料呢？

A5：我们试剂盒里面包含TSA荧光染料、染料稀释液、二抗、DAPI、抗荧光淬灭封片剂，除了这些以外的试剂都是需要您自己准备的，按照免疫组化的试剂准备即可。最重要的是您需要配备荧光成像设备。

Q6：我们实验室有荧光设备，但我不知道能否用来观察多色？

A6：您需要确认您的荧光设备各个通道的激发波长和发射波长（可以咨询仪器厂家），跟我们荧光染料的波长做匹配（见下表），我们提供的是最佳波长，在该波长下能够得到很好的成像效果，但假如参数相差30nm，也是可以观察到的；如果您确实无从得知具体的仪器参数，那也可以做一些近似波长匹配，比如您知道您的显微镜可以观察FITC，那么对应Absin多色染料近似是TSA520；如果您发现您仪器的个别通道也不在我们近似波长的清单中，比如Texas Red，那您可以查一些资料确认一下该染料的激发波长和发射波长（Texas Red EX/EM：570/600nm），再去对应Absin的染料参数，跟TSA620（EX/EM：590/620nm）比较近，激发和发射波长都在30nm范围内，那么判断该通道是可以观察TSA620这个染料的。但染料近似匹配还是有可能存在观察不了的情况，确认仪器参数是很精准的，如果最后发现染完色确实成像不了，也可以咨询Absin扫片服务哦。

表1 Absin多色荧光染料波长对照表

表3 Absin多重荧光免疫组化全套解决方案