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人结直肠癌类器官培养攻略

更新时间:2023-06-28      点击次数:692
原代培养

 

一、准备工作

1、仪器设备

CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床,医用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、眼科剪、眼科镊。

2、试剂耗材

人结直肠癌类器官培养基试剂盒(abs9445)、基质胶(低因子、无酚红)(abs9495)、60mm细胞培养皿(abs7005)、100μm滤筛(abs7009)、15ml离心管(abs7102)、1.5ml EP管若干(abs7119)、24孔细胞培养板(abs7058)、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。


试剂盒组成:

组分名称

规格

人结直肠癌类器官培养基 A

100ml

原代培养缓冲液 B

250ml

人结直肠癌原代组织消化液 C

30ml

类器官传代消化液 D

30ml

组织保存液 E

100ml

类器官冻存液 F

20ml

类器官传代培养缓冲液 G

250ml



二、操作流程

1、类器官操作流程——样本准备

1)将组织放入含有预冷的(2-8°C)组织保存液 E的取样瓶中(浸没整个组织),4℃从医院/实验室取回。

2)将取样瓶消毒,组织取出放入培养皿样本拍照,并登记,大小,颜色,软硬程度,组织类型等信息。



2、类器官操作流程——清洗、剪碎

60mm细胞培养皿(abs7005)里用2-3ml原代培养缓冲液 B浸泡。用原代培养缓冲液 B清洗三次(每次更换培养皿)后剪碎,剪成大约1-3mm3的组织块静置2次



3、类器官操作流程——消化、过滤

1)向EP管中加入适量人结直肠癌原代组织消化液 C(消化液是组织体积的3-5倍)37℃进行消化10-15min(消化过程中随时观察消化情况)。
2)取少量液体在显微镜下观察,镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后, 加入3倍体积原代培养缓冲液 B 终止消化,用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。


3)使用100μm滤筛(abs7009)进行过滤,取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15ml离心管,于300g 4℃ 富集离心5min后移去上清(清洗一次),添加1ml左右原代培养缓冲液 B转移到1.5mlEP管,重新重悬离心(清洗二次)



4、类器官操作流程——离心、加胶

基质胶计算:第3步后观察收集到的组织体积,添加25倍组织体积的基质胶(abs9495)重悬铺板(金属冰盒或冰上操作)

5、类器官操作流程——点胶、加液

以24孔细胞培养板为例,每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板(金属冰盒或冰上操作),将铺好的培养板放入37培养箱中10-15min成胶添加500-750μl 小鼠正常类器官培养基 A(恢复室温)进行培养

 


 

6、类器官操作流程——观察



传代培养

 

一、类器官传代培养——样本收集

 

1、移液器吸去培养基,每孔添加 1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min

2、移液抢轻柔吹打基质胶,收集在 15ml 离心管中,4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。



 

二、类器官传代培养——样本消化

1、类器官数量不足或体积较小时:300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml 离心管,300g4℃ 离心 5min(如图5)弃去液体进行第3步。

2、类器官数量较多或体积较大时:300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加适量类器官传代消化液 D是类器官悬液的1-2超净台内消化 2-3min(中间可以吹打1-2次)(如图6) ,添加适量类器官传代培养缓冲液 G缓冲液G:传代消化液D=5:1终止消化,300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml( 如图7) 离心管,300g 4℃ 离心 5min 弃去液体进行第3步。(如图4)

 



 

三、类器官传代培养——铺板

类器官收集后,添加25基质胶重悬(基质胶体积:细胞沉淀体积=25:1,每孔25μl(如图8) 基质胶铺在 24孔细胞培养板中,放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul(如图9)人结直肠癌类器官培养基 A


 

四、类器官传代后增殖现象


 

类器官冻存

 

 

1、移液器吸去培养基,每孔添加 1-2ml 左右4℃类器官传代培养缓冲液G放置 2min

2、移液抢轻柔吹打基质胶,收集在 15ml 离心管中,4℃静置 10min(每 6-8 孔为一组) 。

3、300g 4℃ 离心 5min 弃去上清,添加1ml类器官传代培养缓冲液 G重悬移入 1.5ml 离心管,300g4℃ 离心 5min 弃去液体。

4、添加适量类器官冻存液 F,轻柔吹打重悬,以24孔细胞培养板为例:密度为2个孔冻存 1管(500个/ml密度冻存),每管体积1.4ml

5、冻存方法
1)将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。

2)4℃冰箱放置30 min,转移至-20℃放置1 h,最后移至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。

 

类器官复苏

 

1、实验前准备

 

1)将水浴锅预热至37℃;

2)细胞实验室进行常规消毒,用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面;

3)在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。


 

2、取出冻存管

1)根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2)从液氮罐中取出冻存盒,取出所需的冻存管,同时核对冻存管外的编号。

 


3、迅速解冻

迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻,并要不断地摇动,使管中的液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁,再拿入超净台内。

4、将类器官组织液移入15ml离心管,添加类器官传代培养缓冲液 G 10ml重悬,轻柔吹打混匀,300g 4℃ 离心 5min。

5、弃上清,添加1ml 类器官传代培养缓冲液 G重悬将沉淀转移至1.5ml EP管,300g 4℃ 离心 5min,弃去上清。

6、添加25倍基质胶(abs9495重悬(基质胶体积:细胞沉淀体积=25:1),每孔25μl基质胶铺在 24孔细胞培养板中,放置培养箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 人结直肠癌类器官培养基 A



类器官鉴定

 

一、类器官鉴定——类器官收集


 

1、类器官收集;

2、清洗1-3遍,洗去大部分基质胶,离心弃去大部分上清。

二、类器官鉴定——琼脂糖凹槽制备


 

三、类器官鉴定——固定

 

四、类器官鉴定——包埋


 

五、类器官鉴定——HE染色


 

六、类器官鉴定——HE染色结果(以肺癌为例)


 

今天讲解就到这了,大家如有类器官问题,欢迎公众号“AG8亚国服务生物"留言交流哦!



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