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分子实验之如何保证样本核酸稳定?

更新时间:2023-11-17      点击次数:757

科研狗起早摸黑做了几天分子克隆实验,

本想着拖了好几个星期的实验终于要做完啦!瞬间觉得自己棒棒哒!

但是最后看实验结果!!! 原地裂开


 

排查实验试剂,没问题!

排查实验操作,没问题!

排查仪器,没问题!

那么问题到底出在哪呢?


 

其实问题有可能出现在样本保存与前处理步骤中哦。生物样本中的核酸(DNA/RNA)会因为核酸酶、温度、pH值、微生物、自身化学性质等因素而发生被动或主动降解,从而导致分子实验结果不尽人意。目前针对不同科研的需求,更多的样本保存方式也相继问世,小爱为大家汇总了各类样本保存的步骤、注意事项、以及样本保存耗材或保存液的推荐。


一、实验样本主要类型:

 

分子实验中主要的样本类型有:纯核酸类、组织类、细胞类及环境类。不同样本具有不同的保存方式以及操作注意事项。


图1 常见的实验样本类型

 

表1 不同类型样本核酸保存方法及稳定性


类型

检测目标

稳定性及保存注意事项

组织

DNA/RNA

新鲜组织应尽快加入到含有核酸保护剂的管中,放置于冰上运输至实验室;石蜡包埋组织中的核酸在室温即可保持稳定。

血液

全血的DNA/RNA

DNA:全血室温可稳定保存24h,2-8℃稳定保存72h,-20℃可长期保存

RNA:室温不建议保存,样本应至于含有核酸稳定剂的管中,放置于冰上运输至实验室。

血清/血浆的cfDNA/ctDNA/病毒DNA/病毒RNA

cfDNA:2-8℃,8h内分离血浆,-20℃或更低温度稳定保存;

ctDNA:抽血后4-5h内即需要完成核酸提取;

病毒DNA:2-8℃稳定一周,-20℃稳定一年以上;

病毒RNA:2-8℃,6h内分离血浆,-20℃或更低温度保存

干血片的DNA

室温稳定保存19个月,需要注意防潮。

细胞

DNA/RNA

37℃保持细胞活力即可。

骨髓

RNA

必须在采集后立即至于RNA稳定剂中,或者于液氮中速冻

胸水、脑水、脑脊液等其他生物体液样本

DNA

低温(2-8℃)保存,尽快提取检测。




 

二、实验样本前处理步骤及注意事项

 

1、组织样本:


块状组织样本短时间内无法充分裂解,一般需要进行样本预处理。组织取材在组织离体30min内完成,取样的动作要尽量快速利索,将组织按任一方向切成黄豆粒大小。


组织DNA提取:新鲜组织样本用生理盐水清洗2次,即刻进行实验。如若不立即进行实验,可用液氮速冻,-80℃冻存。


组织RNA提取:将动物或植物组织切成小块,在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理,快速转入装有1mL Trizol(abs60154)的2mL离心管中,立即进行实验。若后期再进行实验,尽量保存时将样本浸入RNA样品保存液(abs9268)后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNA样品保存液渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱。或者液氮研磨组织,加入Trizol,放入-80℃保存。


图2 组织样本RNA提取流程图

 

2、细胞样本:


DNA提取:细胞收集沉淀后,进行液氮速冻,-80℃保存。


RNA提取:

1)贴壁细胞:吸尽培养液,每10cm2培养面积加入1mL Trizol,用加样器吹打数次,以确保细胞裂解,然后转移至离心管中。注:贴壁细胞Trizol的使用量应由培养皿表面积决定,而非由细胞数目决定。Trizol量不足可能导致提取的RNA中有DNA污染;
2)悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,每5-10×106动植物或酵母细胞,或每1×107细菌细胞加入1mL Trizol,用加样器吹打,使其裂解,然后转移至离心管中。 注:添加Trizol前切勿洗涤细胞,以免RNA降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞。若后期再进行RNA提取实验,细胞用液氮速冻,-80℃冻存。

 

3、血液样本:


采用含有抗凝剂的真空采血管保存即可。但采血管中的抗凝剂种类多样,抗凝剂的种类也会直接影响后续检测结果,面对这么多的采血管如何进行选择?我们建议使用EDTA或枸橼酸钠抗凝管,不建议使用肝素抗凝管(因肝素在后面的核酸提取过程中很难去除,且肝素对PCR反应有很强的抑制作用,因此不建议使用肝素抗凝管)。采集完血液,颠倒混匀备用。另外冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶,因此在冰冻前加入Trizol,切勿直接冻存新鲜血液,保存好的血液应避免反复冻融。

 

4、血清/血浆样本:


全血不加抗凝剂分离的上清是血清,加入抗凝剂分离的上清是血浆。取全血后,静止1-2h,置于离心机3000rpm离心15min即可获得血清或血浆。


三、样本前处理利器—RNA样品保存液(abs9268)

 

RNA样品保存液是一种无毒的可直接使用的样品储存液,能使细胞内的RNARNA酶分离,防止样本中RNA表达谱发生变化。加入样本保存液的样本中RNA在室温可以保存7天4℃可以保存4周-20℃-80℃标本可以长期保存。在RNA样品保存液中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。

 

操作步骤:

1)计算保存液用量:根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNA样品保存液用量;a:RNA样品保存液的用量应当是组织体积的10倍(100mg组织约用1mL RNA样品保存液);b:离心收集2×107细胞RNA样品保存液的用量是1mL;
2)分装:RNA样品保存液按需要量分装入自备保存管中;
3)切片:快速将较大的组织切成厚度<0.5cm的任意片状,较小的组织直接取下,立即浸入RNA样品保存液中;
4)保存:保存时先将样本浸入RNA样品保存液后置4℃冰箱过夜,然后转移到-20℃冰箱或继续转移至-80℃冰箱。


四、本期小爱产品推荐


货号

产品名称

规格

abs9268

RNA样品保存液

100mL

abs9474

组织保存液

100mL

abs60150

RNA酶抑制剂

2000U

abs60154

Trizol

100mL

abs9259

无酶无菌水(DEPC水)

500mL





 



Absin特色产品线:

WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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